Summary
علينا أن نظهر أن التعبير أكثر من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز حركية من خلايا الجذعية العصبية (NSCs) باستخدام agarose هلام رواية الجهاز ميكروفلويديك القائمة. يمكن أن تكون قابلة للتكيف هذه التكنولوجيا بسهولة لغيرها من نظم خلايا الثدييات الخلية حيث قالت مصادر شحيحة ، مثل الخلايا الجذعية العصبية ، وبدوره حولها الساعة الحرجة.
Abstract
في حين أن تكنولوجيا ميكروفلويديك هو التوصل إلى مستوى جديد من النضج لفحوصات الجزيئات ، خلية مقرها المقايسات لا تزال في مرحلة الرضع 1. هذا هو إلى حد كبير بسبب الصعوبة التي يمكن للمرء أن إنشاء خلية المكروية متوافق مع وثابتة باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق والمواد التقليدية. علينا معالجة هذه المشكلة عن طريق ادخال مادة التصنيع الدقيق الرواية ، agarose هلام ، والمادة الأساسية للجهاز ميكروفلويديك. Agarose هلام هو طيع للغاية ، ونفاذا إلى الغاز والمواد المغذية الضرورية لبقاء الخلية ، وبالتالي مادة مثالية لخلية مقرها المقايسات. لقد أظهرنا سابقا أن الأجهزة agarose هلام تستند نجحت في دراسة جرثومية والعدلة الهجرة الخلية 2. في هذا التقرير ، هي منقوشة ثلاث قنوات ميكروفلويديك موازية في الغشاء agarose هلام سمك 1MM تقريبا. تتم المحافظة على تدفقات مستمرة مع وسائل الاعلام / العازلة في القنوات الجانبين باستخدام مضخة تمعجية. تتم المحافظة على الخلايا في قناة مركز للمراقبة. منذ المغذيات والمواد الكيميائية في القنوات الجانبية نشرها باستمرار من جانب إلى مركز القناة ، والبيئة الكيميائية للقناة المركز هو السيطرة عليها بسهولة عن طريق تدفق على طول قنوات جانبية. باستخدام هذا الجهاز ، ونحن إثبات أنه يمكن رصد حركة الخلايا الجذعية العصبية بصريا مع سهولة في ظل الظروف الكيميائية المختلفة ، والنتائج التجريبية تبين أن أكثر من التعبير البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز من القدرة على الحركة من الخلايا الجذعية العصبية. حركية من خلايا الجذعية العصبية هي العلامات البيولوجية الهامة لتقييم الخلايا العدوانية ، وبالتالي عامل مكون للأورام 3. سوف فك رموز آلية حركية الغلة الكامنة NSC نظرة ثاقبة على حد سواء الاضطرابات العصبية والتنمية في سرطان الدماغ الجذعية غزو الخلايا.
Protocol
إجراء
شرائح طلاء مع فبرونيكتين
قبل تركيب الجهاز ميكروفلويديك ، تعقيم شرائح الزجاج مع فبرونيكتين. معطف الشرائح في biohood للحفاظ على العقم. هل محاذاة PDMS العقيمة على طول حواف الشريحة ووضع علامة على الجانب الذي يواجه حتى مع علامة دائمة. ماصة 1 مل من محلول ميكروغرام / 5 مل من فبرونيكتين (سيغما) داخل هل PDMS على كامل الشريحة الزجاجية. مغادرة الشرائح دون عائق لمدة ساعة ، ثم جافة تماما باستخدام قدرها 2 N البندقية. ويمكن تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية في وقت لاحق لاجراء تجارب.
تجميع الجهاز
ويتم تجميع الجهاز بأكمله في بروتوكول biohood تحت ظروف معقمة ، وذلك باستخدام الإجراءات التالية :
- تنظيف رئيسية السيليكون مع microchannels منقوشة عليها من قبل القضاء عليه مع 70 ٪ من الإيثانول والتجفيف مع مدفع 2 N. هل وضع PDMS العقيمة من ارتفاع 1 ملم باستخدام الملقط حول ميزات تخفيف الرئيسية.
- تحضير هلام agarose المستخدمة في الجهاز عن طريق وزنها 0.3 غرام من مسحوق agarose (فيشر العلمية) و 10 مل من ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة (Invitrogen) في دورق 50 مل. يحرك الخليط مع ملعقة والحرارة في الميكروويف لمدة 20 ثانية على ارتفاع. إذا حبيبات غير منحل موجودة ، حرارة المزيج لمدة 10 ثانية ودوامة الخليط الساخن للتخلص من آخر ما تبقى حبيبات. كرر هذه العملية مع الوقت التدفئة من 8 ثوان ، ومن ثم 5 ثوان.
- من أجل حل بسرعة agarose على سيد السيليكون محاطة هل PDMS وتغطية الخليط على الفور agarose مع شريحة زجاجية معقمة. تطبيق المستمر ، والضغط لطيف إلى الشريحة لحوالي 2 دقيقة للتأكد من أن agarose سوف هلام إلى نفس الارتفاع المستمر ملم (1) بوصفها هل PDMS.
- بعد agarose المواد الهلامية ، انزع agarose هلام منقوشة مع PDMS هل من السيليكون الرئيسي ونقلها إلى شريحة زجاجية مغلفة مع فبرونيكتين microchannels في هلام agarose تواجه الشريحة. استخدام غيض حقنة قياس 16 لكمة ثقوب في مناطق الخزان من microchannels عن مدخل ومخرج يصل. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المستقلة CO 2 إلى هلام agarose منقوشة على الشريحة لمنع جفاف في microchannels.
- غسل المتعددة الاكريليك المستخدمة في الجهاز مع 70 ٪ من الإيثانول والشطف بالماء DI. محاذاة الفتحات الموجودة في مشعب مع ثقبا في agarose هلام مع microchannels. ثم ، محاذاة متعددة مع هلام ، هل PDMS ، والشريحة فبرونيكتين مع الإطار المعدني للجهاز. مكان البراغي في الجهاز وتشديد إلى نقطة المقاومة باستخدام مفك. يتم ذلك لضمان عدم الإفراط في الجهاز شددت الى حد التشويه وmicrochannels في agarose. تشديد الخناق في ترتيب عقارب الساعة للتأكد من أن جل داخل الجهاز لا تحول. اختبار الجهاز للكشف عن التسربات وانسداد في microchannels باستخدام المحاقن 1ml. يتم تركيب أنابيب المحقنة مع Tygon مع طرف ماصة هلام التحميل في نهاية الأنبوب لحقن ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة في microchannels. ويعتبر الشخص متناهية شكلت بنجاح عندما لاحظ وسائل الاعلام فقط للخروج من مأخذ للمتناهية عندما يتم حقن سائل الإعلام في مدخل المناظرة. الآن ، الجهاز جاهزا للاستخدام.
إعداد والبذر للخلايا في الجهاز
عندما الخلايا تصل إلى 70 ٪ (حوالي 100،000 كثافة خلية خلية / مل) confluency ، انهم مستعدون ليكون المصنف في الجهاز.
تخضع هذه الخلايا لمدة DPBS (Invitrogen) يغسل. إضافة 200 ميكرولتر من التربسين - EDTA (Invitrogen) لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على وسائل الإعلام 5ml M2 تحتوي على مصل لإبطال نشاط التربسين. طرد وسائل الاعلام مع نمو الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. يستنشق قبالة طاف وresuspend الكرية من الخلايا 5 مل من DPBS. الطرد المركزي الخلايا DPBS مرة أخرى تحت نفس الظروف. يستنشق قبالة طاف مرة أخرى ، وresuspend الكرية من الخلايا في 500 ميكرولتر من CO 2 وسائل الإعلام المستقلة.
التعليق البذور الناتجة من الخلايا في مركز متناهية من الجهاز عن طريق الجاذبية يحركها التدفق. إضافة مدخل ومخرج للمركز متناهية مع 60 ميكرولتر من التعليق الخلية و 20 ميكرولتر من المتوسط 2 - مستقلة أكسيد الكربون ، على التوالي. مركز مراقبة تحت المجهر متناهية brightfield للبحث عن التصاق الخلية. الخلايا تلتزم عادة بعد 10 دقيقة. بعد الخلايا الانضمام إلى أسفل القناة في مناطق ذات كثافة الصحيح ، pipeted خارج الخلية تعليق المتبقية في مدخل ومخرج في وسائل الاعلام. 60 ميكرولتر مكان من ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة في كل من مدخل ومخرج للقناة الوسط. مكان PDMS يغطي ما يزيد على عشرةه مركز مدخل ومخرج لتقليل التبخر من وسائل الإعلام من قناة الوسط.
تصوير الخلايا في الجهاز
قبل تجميع الجهاز ، الصفحات الأنبوب عقيمة تمعجية من خلال محطة الطقس من المجهر (أوليمبوس X81) والتواصل مع مضخة تمعجية (واطسون ، مارلو 205U/CA). دافق من خلال برنامج تلفزيوني الأنبوب بمعدل 4 دورة في الدقيقة. بعد تجميع الجهاز وإعداد تركيزات مناسبة من عامل نمو البشرة (EGF) (سيغما) الحلول في وسائل الإعلام المستقلة 2 - CO في أنابيب الطرد المركزي 15 مل. دوامة الحلول EGF لمدة 5 ثوان والتواصل مع الأنابيب. توصيل الأنابيب التي تحمل تركيزات EGF المقابلة للجهاز. الامر يستغرق نحو ساعة لEGF لنشر عبر التلال وإنشاء قناة التدرج كيميائية ثابتة.
يتم استخدام البرمجيات والتصوير ، وSlidebook ، باتخاذ مجموعة من الصور في كل 10 دقائق لحوالي 5 ساعات في تشغيل التجريبي. وتمت برمجة مرحلة XY الآلي بحيث يتم تصوير فريقين فرعيين المناطق (كل بمساحة x400μm 400μm) من قناة نفس المركز ، ومجموعه قنوات المركز الثلاثة في نقطة زمنية معينة. الخلايا في قنوات مختلفة مركز (عادة 3 في واحد تشغيل) وتركيزات مختلفة EGF ، وضعت في الأنابيب.
مواد ومعدات
خطوط الخلية : C17.2 NSCs الخلايا المشتقة من الطبقة الخارجية للمخيخ جرثومي الماوس بعد الولادة 6 ، 7. استخدام هذا الخط الخلية ، وضعنا اثنين آخرين من الخلايا الجذعية باستخدام خطوط الفئران الارتجاعي ترنسفكأيشن الأسلوب. هذين ستابلي transfected خطوط الخلايا هي : (1) wtEGFR -- أن الإفراط في الإنسان تعرب عن EGFR نوع البرية ، و (2) ΔEGFR -- التي هي متحولة EGFR constitutively النشطة. لسهولة الكشف والفيروسات القهقرية تحمل العمود الفقري مع الجين المصالح يعقبه موقع الداخلية للربط الريباسي (IRES) والبروتين الفلوري الأخضر (GFP).
خلية ثقافة : كانت تزرع الماوس C17.2 NSCs والمتغيرات في لوحة 6 - M2 جيدا في وسائل الإعلام (DMEM (Invitrogen) مع 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) (Invitrogen) ، و 5 ٪ مصل الحصان (HS) (Invitrogen ) ، و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين (Invitrogen)) واستمرت الخلايا في درجة مئوية و 37 في الهواء بنسبة 80 ٪ و 5 ٪ CO 2.
ميكروفلويديك الجهاز : مشعب بلاستيكية وهل PDMS ، والإطار الذي لا يصدأ لعقد الجهاز في مكانه.
التصوير
ويستخدم مجهر مقلوب فلوري (أوليمبوس IX - 81) ، في اتصال مع كاميرا CCD المكثف (أوركا ، هاماماتسو). هي التي شنت على الجهاز ميكروفلويديك مرحلة XYZ الآلي ، ويتم تضمينه في المرحلة قبل الغرفة البيئية التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية. عادة ما تكون هناك أجهزة 3-4 على الشريحة نفسها التي سيتم تصويره في الوقت نفسه باستخدام نقطة مرحلة XYZ الآلي.
الحفاظ على التدفق
ويستخدم مضخة تمعجية مع 8 خطوط متوازية (واطسون ، مارلو 205U/CA) للحفاظ على تدفق السيارات في جميع المصارف وقنوات المصدر.
التين. 1 سلالات NSC على الحركة الثلاثة (الوالدين ، wtEGFR وEGFR D) في تركيزات مختلفة EGF تؤخذ جميع المسارات من تعقب فيلم من 5 ساعات (باستثناء wtEGF 100ng/ml ، 4hour) ، وكان منشأ جميع المسارات تعديل أوضاعها في (0،0) لغرض المقارنة.
التين. 2 العددية بين مستوى التعبير والحركة EGFR (أ) صورتين من NSCs wtEGF على سطح قناة ميكروفلويديك مع EGF 100ng/ml. الصورة اليسرى هي صورة الفلورسنت ، والحق هو حقل الصورة المنقولة مشرق. شريط المقياس 100μm ، و قناة العرض هو 400 ميكرون. يتم فصل الخلايا في اثنين من السكان من قبل سطوع GFP التي أعرب عنها. الخلايا في الدوائر الزرقاء هي باهتة ، وبالتالي أقل EGFR مستوى التعبير ، والخلايا في الدوائر الحمراء هي brigher ، وبذلك أعلى مستوى التعبير EGFR. (ب) من الخلايا التي تحتوي على مسارات المنخفضة والعالية المستوى EGFR التعبير. وتتخذ هذه المسارات من فيلم مدته ساعة الأربعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التين. 1 يبين مسارات سلالات NSC الثلاثة ، الخلايا الأبوية ، وwtEGFR وΔEGFR على (السيطرة). تم الحصول على كل مجموعة من المسارات من الفيلم 5 ساعات طويلة. لخلايا الوالدين ، بلغت ذروتها عندما خلية حركية EGF كان تركيز ~ 10ng/ml ؛ wtEGFR للخلايا ، خلية حركية تحولت إلى ذروة 100ng/ml أو أعلاه ؛ ΔEGFR للخلايا ، والخلية كانت حركية مستقلة EGF التركيز كما هو متوقع.
انتقلوا مع الخلايا wtEGF 100ng/ml كانت معظم الخلايا متحركة ، نحو 1.5 مرات أسرع من الخلايا الأبوية مع 10ng/ml. هذا يدل على أن (1) على التعبير عن EGFR يعزز خلايا حركية ، (2) في عدد من المناسبات EGF المتعهدة يجند مستقبلات له تأثير مباشر على حركية الخلية. ΔEGFR خط الخلية هي متحولة EGFR constitutively النشطة. هذا المسخ يظهر في 60 ٪ من ورم أرومي دبقي ~ الإنسان. انها مجال اقتطاع خارج الخلية تصبح نشطة التأسيسية يجند مستقلة كيناز. شدة autophosphorylation صغيرة (حوالي 10 ٪) مقارنة مع يجند تنشيط البرية من نوع EGFR (wtEGFR) 4. هذه الملاحظة التي تكمن وراء الخلايا ΔEGF وحركية أعلى قليلا من الوالدين وwtEGFR (في غياب EGF) ، ولكن يتم الاحتفاظ حركية مستمرة في تركيزات مختلفة EGF.
منذ خلايا wtEGFR نفذت نسخ نفسه من GFP (بروتين الفلورية الخضراء) وEGFR ، وكثافة الخلايا الفلورسنت wtEGFR تكشف عن مستويات التعبير EGFR. وهذا يسمح لنا لربط مباشرة بروتين تعبير المستوى EGFR (كثافة الفلورية الخضراء) مع حركية الخلية. التين. 2 يبين المسارات للسكان الخلية ، وهما الخلايا في الدائرة الحمراء هي أكثر إشراقا ، وبالتالي قد أعلى مستوى التعبير EGFR ، والخلايا في الدائرة الزرقاء والعشاء ، وبالتالي انخفاض مستوى التعبير EGFR. النتائج تثبت مرة أخرى أنه كلما ارتفع مستوى التعبير EGFR ، والمزيد من هذه الخلايا هي متحركة.
تقليديا ، وقد تم تحديد حركية من NSCs باستخدام مقايسة بويدن الغرفة ، حيث يتم تقييم نسبة الخلايا المهاجرة عبر غشاء 5. هذا هو أساس مقايسة السكان ، حيث لا يمكن سلوك الخلية يتم تقييمها بشكل فردي. الجهاز ميكروفلويديك هو موضح هنا فرصة لدراسة الاقتراح على مستوى الخلية خلية واحدة ، والمواد الكيميائية في بيئة تسيطر عليها بشكل جيد فإنه يسمح احد ، لأول مرة ، لربط مباشرة على مستوى بروتين تعبير EGFR مع النمط الظاهري حركية NSCs في الخلايا الحية. صغر حجم الجهاز مفيدا بشكل خاص للتجارب الخلايا حيث مصادر محدودة ، مثل الخلايا الجذعية البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويؤيد هذا العمل من قبل مكتب ولاية نيويورك للعلوم والتكنولوجيا والبحث العلمي (NYSTAR) (في شكل مركز التكنولوجيا المتقدمة منحة) ، والمنح المقدمة من مركز النانوية (NBTC) ، وهو برنامج للمجلس الوطنى لشركة الاتصالات السعودية مؤسسة العلم تحت رقم 9876771 - ECS الاتفاق ، واستئصال ورم من الدماغ الرابطة الأمريكية وأكاديمية نيويورك للطب (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
