Summary
우리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 이상의 표현은 소설 아가로 오스 겔 기반 microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포 (NSCs)의 운동성 향상 것을 보여줍니다. 이 기술은 인간의 신경 줄기 세포와 같은 세포 소스가 없어서 다른 포유 동물 세포 시스템에 쉽게 적응할 수 있으며, 시간을 주변의 차례가 중요합니다.
Abstract
microfluidic 기술 macromolecular의 assays를위한 성숙의 새로운 수준에 도달하는 동안 셀 기반의 assays은 유아 단계 1 아직 없습니다. 이것은 하나가 기존 microfabrication 기술과 재료를 사용하여 셀 - 호환 꾸준한 microenvironment를 만들 수있는 어려움에 크게 때문입니다. 우리는 microfluidic 장치의 기본 재료로, 소설 microfabrication 소재, 아가로 오스 겔의 도입을 통해이 문제를 해결합니다. 아가로 오스 겔은 셀 기반의 assays를위한 이상적인 소재 때문에 높은 가단, 가스 및 세포 생존에 필요한 영양분을 침투성이며,. 우리는 아가로 오스 겔 기반 장치 세균 및 호중구 세포 이주 2 공부에 성공했는지 이전에 나타났습니다. 이 보고서에서는 세 병렬 microfluidic 채널이 약 1mm 두께의 아가로 오스 겔 막에 패턴입니다. 미디어 / 버퍼 상수 흐름은 연동 펌프를 사용하여 두 개의 사이드 채널 유지하고 있습니다. 세포 관찰을위한 중앙 채널에 유지됩니다. 측면 채널에서 영양분과 화학 물질의 측면에서 중심 채널, 센터 채널의 화학적 환경에 지속적으로 diffusing 있기 때문에 쉽게 한쪽 채널을 따라 흐름을 통해 제어됩니다. 이 장치를 사용하여, 우리는 신경 줄기 세포의 움직임이 다양한 화학 조건 하에서 쉽게 광학 모니터링 수 입증하고, 실험 결과는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 이상의 표현이 신경 줄기 세포의 운동성 향상 것을 보여줍니다. 신경 줄기 세포의 운동성은, 따라서 tumorigenic 요인 3 세포의 공격성을 평가하기위한 중요한 biomarker입니다. NSC의 운동성을 기본 메커니즘을 파악하는 것은 신경 발달의 장애로 모두와 뇌 암 줄기 세포 침공에 대한 통찰력을 얻을 것입니다.
Protocol
절차
fibronectin과 코팅 슬라이드
이전 microfluidic 장치의 조립에, fibronectin과 유리 슬라이드를 소독. 코트 biohood에서 슬라이드 불임을 유지합니다. 슬라이드의 가장자리를 따라 멸균 PDMS 스페이서를 정렬하고 영구 마커와 직면하고있는 측면을 표시합니다. 유리 슬라이드의 전체에 걸쳐 PDMS 스페이서 내부 fibronectin의 5 μg / ML 솔루션 (시그마)의 피펫 1 ML. 시간 동안 그대로 슬라이드를 남겨 후, 완전히 N 2 총을 사용하여 건조. 슬라이드는 나중에 실험 4 O C에서 저장할 수 있습니다.
장치를 조립
전체 장치 조립 프로토콜은 다음 절차를 사용하여 무균 조건 하에서 biohood에서 이루어집니다 :
- 70 % 에탄올로 닦고와 N 2 총을 들고 건조하여 그 위에 패턴 microchannels와 실리콘 마스터를 청소합니다. 마스터의 구제 기능 주변 집게를 사용하여 1mm 높이의 살균 PDMS 스페이서를 놓습니다.
- 아가로 오스 분말 0.3 g (피셔 과학)와 CO의 10 ML 무게에 의해 장치에 사용되는 아가로 오스 겔의 준비 2 독립 미디어 (Invitrogen) 50 ML의 비커 인치 높이 20 초 동안 전자 레인지에 주걱 및 열로 혼합물을 저어. 소화 되 다만 과립이있는 경우, 또 다시 10 초 소용돌이 마지막으로 남아있는 과립을 없애기 위해 가열 혼합물에 대한 혼합물을 가열. 8초의 가열 시간과 과정을 반복한 다음 오초.
- 신속 PDMS 스페이서 둘러싸인 실리콘 마스터에 아가로 오스 솔루션을 부어 즉시 멸균 유리 슬라이드와 아가로 오스의 혼합물을 커버. 보장하기 위해 약 2 분 동안 슬라이드 지속, 부드러운 압력을 적용하는 아가로 오스 PDMS 스페이서와 같은 상수 1mm 높이로 젤 것입니다.
- 아가로 오스 젤 후, 실리콘 마스터와 슬라이드를 마주 아가로 오스 겔에서 microchannels과 fibronectin 코팅 유리 슬라이드로 전송에서 PDMS 스페이서와 패턴 아가로 오스 겔에서 껍질. 입구와 출구의 액세스에 대한 microchannels의 저수지 지역에 구멍을 펀치를 16 게이지 주사기의 끝부분을 사용합니다. microchannels의 건조를 방지하기 위해 슬라이드에있는 패턴 아가로 오스 겔에 CO 2 - 독립 미디어 500 μl를 추가합니다.
- 70 % 에탄올로 장치에 사용되는 아크릴 매니폴드를 씻고 디 물로 헹굼. microchannels와 아가로 오스 겔에 펀치 구멍과 매니폴드에있는 구멍을 맞춥니다. 그런 다음, 젤, PDMS 스페이서 및 장치의 금속 프레임과 fibronectin 슬라이드와 매니폴드를 맞춥니다. 장치에 나사를 삽입하고 드라이버를 사용하여 저항의 지점으로 조입니다. 이것은 장치가 아가로 오스의 microchannels를 deforming의 범위 이상으로 강화되지 않도록하기위한 것입니다. 장치 내부의 젤 이동하지 않도록하기 위해 시계 방향으로 순서대로 나사를 조이십시오. 1ml 주사기를 사용하여 microchannels의 누출 및 폐색 장치를 테스트합니다. 주사기는 microchannels에서 CO 2 - 독립 미디어를 삽입하는 튜브의 끝에 젤 - 로딩 피펫 팁과 Tygon 튜빙가 장착되어 있습니다. microchannel은 미디어가 미디어가 해당 입구에 주입되었을 때에만 microchannel의 콘센트에서 종료 관찰되었을 때 성공적으로 형성 것으로 간주됩니다. 이제 장치를 사용할 준비가되었습니다.
장치에있는 세포를 준비하고 심는
세포 (100000 셀 / ML 주변의 세포 밀도) 70% confluency에 도달하면, 이들은 장치에 씨앗을 할 준비가되어 있습니다.
이 DPBS에 세포 제목 것은 (Invitrogen) 씻는다. 세포를 분리하는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Invitrogen) 200 μl를 추가합니다. 트립신을 inactivate하는 혈청을 포함하는 M2 미디어 5ml를 포함한 15 ML의 원심 튜브에 세포를 전송합니다. 5 분 1,000 RPM에서 세포로 성장 미디어를 Centrifuged. 뜨는 떨어져 Aspirated 및 세포 펠릿 DPBS 5 ML을 resuspend. 동일한 조건에서 다시 DPBS 세포를 원심 분리기. 다시 뜨는에서 Aspirated 및 CO 500 μl 2 독립 매체 세포의 펠렛을 resuspend.
중력 중심 흐름을 통해 장치의 microchannel 센터에 씨앗 세포의 결과 정지합니다. 각각의 세포 현탁액의 60 μl와 CO 2 - 독립 매체 20 μl로 microchannel 중심의 입구와 콘센트를 추가합니다. 세포 점착 찾아 브라이트 현미경 아래 microchannel 센터를 관찰합니다. 세포는 보통 10 분 후에 준수. 세포는 적절한 밀도의 채널 하단을 준수 입구에 남아있는 세포 현탁액 및 콘센트에서 미디어를 pipeted. 후 센터 채널의 입구와 콘센트 모두 CO 장소 60 μl 2 - 독립 미디어. 장소 PDMS는 일 이상 커버E 센터 입구와 콘센트는 센터 채널에서 미디어의 증발을 최소화합니다.
이미징 장치에있는 세포
이전 장치의 조립, 현미경의 날씨 스테이션 (올림푸스 X81)을 통해 멸균 연동 튜브를 스레드와 연동 펌프 (왓슨 - 말로 205U/CA)와 연결합니다. 4 RPM의 속도로 튜브를 통해 PBS를 플러시. 장치의 조립 후 15 ML의 원심 분리기 튜브의 CO 2 - 독립 미디어에 표피 성장 인자 (EGF) (시그마) 솔루션의 적절한 농도를 준비합니다. 소용돌이 EGF 5 초 동안 솔루션과 튜브로 연결합니다. 장치에 해당하는 EGF의 농도로 표시된 tubings를 연결합니다. EGF는 채널 산등성이에 걸쳐 확산과 지속적인 화학적 기울기를 설정하는 것은 시간 정도 걸립니다.
이미징 소프트웨어, Slidebook는 실험 실행에 약 5 시간 10 분 간격에서 이미지의 설정을하는 데 사용됩니다. XY 자동 단계는 프로그래밍하는 것과 동일한 중심 채널, 3 채널 센터 총 두 개의 하위 영역 (400μm의 x400μm의 면적 각) 특정 시점에 몇 군데 있다고 이러한. 다른 센터 채널 (일반적으로 3 일 실행)에있는 세포로 튜브에 표시된 다른 EGF의 농도를했습니다.
재료 및 장비
셀 라인 : C17.2 세포는 출생 후의 마우스 소뇌 6, 7의 외부 새싹 계층에서 파생 NSCs 있습니다. 이 세포주를 사용하여, 우리는 레트로 바이러스의 transfection 방법을 사용하여 두 개의 다른 murine 줄기 세포 라인을 개발했습니다. 이 두 안정 transfected 세포 라인 (1) wtEGFR 있습니다 - 인간의 야생 유형 EGFR을 통해 - 표현되는, 그리고 (2) ΔEGFR - 그게 constitutively 적극적인 EGFR의 돌연변이이다. 검색의 용이성을 위해, retroviruses는 ribosomal 바인딩 (IRES)와 녹색 형광 단백질 (GFP)의 내부 사이트 다음의 이익을 유전자와 기개를 가지고 다니십시오.
세포 배양 : 마우스 C17.2 NSCs과 변종은 M2 미디어에 6 잘 플레이트 (10 % 태아 소 혈청 (FBS) (Invitrogen) 5 % 말 혈청 (HS) (Invitrogen과 DMEM (Invitrogen)에 성장했다 ), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen).) 전지는 80 %를 공기와 5% CO 2 37 O C에서 유지되었다.
Microfluidic 장치 : 플라스틱 매니폴드, PDMS 스페이서, 장소에 장치를 개최 스테인레스 프레임.
이미징
거꾸로 형광 현미경 (올림푸스 IX - 81)을 강화 CCD 카메라 (오카 하마 마츠)와 관련하여 사용됩니다. microfluidic 장치는 자동 XYZ 무대에 탑재되며, 무대는 37 O C의 온도를 유지 환경 챔버가 포함되어 있습니다 자동 XYZ 단계를 사용하여 같은 시점에서 촬영된 것입니다 동일한 칩에 3-4 장치는 일반적으로있다.
유지 흐름
8 병렬 라인 (왓슨 - 말로 205U/CA) 자동과 연동 펌프는 싱크 및 소스 채널의 모든 흐름을 유지하는 데 사용됩니다.
그림. 다양한 EGF의 농도 세 NSC의 종자 1 운동성이 (친권, wtEGFR, 그리고 D EGFR) 모든 궤도 5 시간의 동영상 (wtEGF 100ng/ml, 사시간 제외) 추적에서 찍은, 모든 트랙의 기원이되었다 아르 비교 목적으로 (0,0)에서 치워버 렸어요.
그림. EGFR의 발현 수준과 운동성 (A) 100ng/ml EGF와 microfluidic 채널의 표면에 wtEGF의 NSCs의 두 이미지 2 상관. 왼쪽 이미지는 형광 이미지이고, 오른쪽은 전송 명시야 이미지입니다. 스케일 바 100μm이며, 채널 폭 400 μm의 수 있습니다. 세포 표현 GFP의 밝기하여 두 집단으로 구분됩니다. 셀 파란 동그라미가 주차 아르에 따라서 적은 EGFR 표현 수준을 가지고, 그리고 빨간 동그라미에있는 세포 brigher 있으며, 따라서 높은 EGFR 발현 수준을합니다. 낮은 높은 EGFR 발현 레벨 셀 (B) 궤도. 이 궤도는 4 1 시간 동안 영화에서 가져옵니다.
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Discussion
그림. 1 세 NSC의 변종, 부모 세포, wtEGFR 및 ΔEGFR (제어)의 탄도를 보여줍니다. 궤도의 각 세트는 5 시간 동안 영화에서 얻은되었습니다. EGF 농도가 ~ 10ng/ml 때 부모의 세포, 세포 운동성는 만족, wtEGFR 세포에 대해, 세포 운동성 피크가 100ng/ml 이상으로 이동, 예상대로 ΔEGFR 세포에서, 세포 운동성는 EGF 농도의 독립했다.
100ng/ml로 wtEGF 세포가 가장 운동성이있는 세포를했다, 그들은 빠르게 10ng/ml과 부모의 전지보다 약 1.5 시간을 옮겼습니다. 이것은 (1) EGFR의 표현을 통해 세포의 운동성 향상을 나타냅니다 (2) EGF 리간드 - 수용체 기다리는 이벤트의 숫자는 세포 운동성에 직접적인 영향을 미치고 있습니다. ΔEGFR 세포 라인 constitutively 적극적인 EGFR의 돌연변이이다. 이 돌연변이 인간 glioblastoma의 ~ 60 %에 나타납니다. 그것은 제정 활성 리간드 독립적인 키나제되고 잘립니다 세포외 도메인을했다. autophosphorylation의 강도는 야생 타입 EGFR (wtEGFR) 4 활성 리간드와 비교하여 (약 10 %) 작습니다. 이 underlies ΔEGF 세포는 부모와 wtEGFR (EGF의 부재에서)보다 약간 높은 운동성을 가지고 있지만, 운동성가 다양한 EGF의 농도에 지속적으로 유지되는 관측.
wtEGFR 세포가 GFP (녹색 형광 단백질)와 EGFR의 동일한 복사본을 수행 때문에, wtEGFR 세포의 형광 강도는 EGFR 발현 수준을 공개. 이것은 우리가 직접 세포 운동성와 EGFR 단백질 발현 수준을 (녹색 형광 강도) 상호 연관 수 있습니다. 그림. 그리고 블루 서클의 세포가 저녁 아르 따라서 낮은 EGFR 발현 수준을 가지고, 2는 두 세포 인구의 궤도가 빨간색 동그라미에있는 세포가 있으므로 높은 EGFR 발현 수준을 가지고는 밝은 아르 보여줍니다. 결과는 다시 높은 EGFR 발현 수준, 더 많은 운동성이있는 이들 세포는 것을 보여줍니다.
전통적으로, NSCs의 운동성는 세포막을 통해 마이 그 레이션하는 세포의 비율이 5 평가 보이던 챔버 분석을 사용하여 결정되었습니다. 이것은 세포의 행동이 개별적으로 평가 수없는 인구 기반의 분석이다. 여기에 표시된 microfluidic 장치는 단일 세포 수준에서 세포의 움직임을 연구하는 기회를 선물하고, 잘 제어 화학 환경 인치 그것은 바로 살아있는 세포에서 NSCs의 운동성의 표현형와 EGFR 단백질 발현 수준을 상관 관계로 처음으로 하나 있습니다. 장치의 작은 크기가 같은 인간 줄기 세포와 같은 세포의 소스는 제한 실험을 위해 특히 유용합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 뉴욕주 과학의 사무실, 기술 및 학술 연구 (NYSTAR) (고급 기술 부여를위한 센터의 형태로)에 의해 및 Nanobiotechnology 센터 (NBTC), 국민의 STC 프로그램에서 교부금에 의해 지원됩니다 계약 번호 항법 - 9876771하에 과학 재단과 미국의 뇌종양 협회와 의학의 뉴욕 아카데미 (잽).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
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