Summary
我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースのマイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。
Abstract
マイクロ流体技術は、高分子のアッセイのために新たな成熟レベルに達している間は、細胞ベースのアッセイは、乳児の第1段階ではまだです。これは、1つは、従来の微細加工技術と材料を使用して、セルと互換性があり、安定した微小環境を作成できる難しさによるところが大きい。我々は、マイクロ流体デバイスのための基材として、新たな微細加工材料、アガロースゲルの導入を介してこの問題に対処しています。アガロースゲルは非常に可鍛性、および細胞の生存、およびそのためのセルベースアッセイのための理想的な材料のために必要なガスと栄養素の透過性です。我々は、アガロースゲルベースのデバイスは、細菌や好中球細胞遊走2を研究することに成功していることが以前に示されている。このレポートでは、つのパラレルマイクロ流体チャネルは、約1mm厚のアガロースゲル膜にパターニングされています。メディア/バッファ付き定数フローは、蠕動ポンプを使用して2つのサイドチャンネルに保持されます。細胞は、観察のためのセンターチャンネルに保持されます。サイドチャネルにおける栄養素や化学物質がサイドからセンターチャンネル、センターチャンネルの化学的環境に絶えず拡散なので簡単にサイドチャネルに沿った流れを介して制御されます。このデバイスを使用して、我々は神経幹細胞の動きは、様々な化学的条件下で容易に光学的にモニターできることを示している、との実験結果は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、神経幹細胞の運動性を高めることを示している。神経幹細胞の運動性は、このように、腫瘍形成因子3細胞の攻撃性を評価するための重要なバイオマーカーです。 NSCの運動の根底にあるメカニズムを解読する神経発達の両疾患に、脳のがん幹細胞の浸潤への洞察が得られます。
Protocol
手順
フィブロネクチンでコーティングスライド
マイクロ流体デバイスの組み立てに先立って、フィブロネクチンでガラススライドを滅菌する。コート無菌性を維持するためにbiohoodにスライド。スライドのエッジに沿って滅菌PDMSのスペーサーの位置を合わせ、永久的なマーカーで上を向いている側をマーク。スライドガラスの全体にわたってPDMSのスペーサー内部のフィブロネクチンの5μg/ mlの溶液をピペット1ミリリットル（シグマ）。時間邪魔されずにスライドを残し、その後N 2銃を使用して完全に乾燥させます。スライドは、後の実験のために4℃で保存することができる。
装置の組み立て
デバイス全体のアセンブリのプロトコルは、次の手順を使用して、無菌条件下でbiohoodで行われます。
- 70％エタノールでそれを消去し、N 2ガ ンで乾燥することによりその上にパターニングされたマイクロチャネルを有するシリコンのマスターを清掃してください。マスターのリリーフ機能周り鉗子を使用して1mmの高さの滅菌PDMSのスペーサを置きます。
- アガロース粉末（フィッシャーサイエンティフィック社）0.3 gと50 mlのビーカーにCO 2に依存しないメディア（Invitrogen社製）10mlを秤量することにより、デバイスで使用されているアガロースゲルを準備します。 HIGHで20秒間電子レンジでへらと熱との混合物をかき混ぜる。未溶解の顆粒が存在する場合は、最後に残った顆粒を取り除くために熱い混合物は、別の10秒とスワールのために混合物を加熱する。 8秒の加熱時間とプロセスを繰り返し、[5秒。
- すぐにPDMSのスペーサーに囲まれたシリコンのマスターにアガロース溶液を注ぐと直ちに滅菌ガラススライドでアガロースの混合物をカバーしています。アガロースは、PDMSのスペーサーと同じ定数1 mmの高さにゲルすることを保証するために約2分間スライドに一定の、穏やかな圧力を与える。
- アガロースゲルの後に、シリコンのマスターとスライドが直面しているアガロースゲルのマイクロとフィブロネクチンコーティングしたスライドガラスへの転送からPDMSスペーサーと模様のアガロースゲルをはがす。入口と出口のアクセスのためのマイクロチャネルの貯留領域に穴を開けるために16ゲージのシリンジの先端を使用してください。マイクロチャネルの乾燥を防ぐために、スライド上にパターニングされたアガロースゲルにCO 2 -独立系メディアの500μlを添加します。
- 70％エタノールでデバイスで使用されるアクリルマニホールドを洗浄し、DI水ですすいでください。マイクロチャネルをアガロースゲルにパンチ穴付マニホールドの穴を合わせます。その後、ゲル、PDMSのスペーサー、およびデバイスの金属フレームとのフィブロネクチンのスライドにマニホールドを合わせます。デバイスにネジを置いて、ドライバーを使って抵抗の点で締めます。これは、デバイスはアガロースのマイクロチャネルを変形の程度に過剰締めされていないことを保証するために行われます。デバイス内部のゲルがずれないことを確認する時計回りの順番でネジを締めます。 1ミリリットル注射器を使用してマイクロチャネルに漏れや閉塞のためのデバイスをテストします。注射器は、マイクロチャネル内のCO 2 -独立系メディアを注入するチューブの端にゲルローディングピペットチップとタイゴンチューブが装備されています。マイクロチャネルは、メディアが、メディアが対応する入口に注入されたときにのみマイクロチャンネルの出口を終了することが観察されている場合、正常に形成みなされます。今、デバイスの使用準備ができています。
デバイス内のセルを準備し、シーディング
細胞がコンフルエント70％（100,000細胞/ ml程度の細胞密度）に到達すると、それらはデバイスに播種されるために準備されています。
two DPBS（Invitrogen）を洗浄の対象セルを。細胞を切断するトリプシン- EDTA（Invitrogen社）を200μlを追加。トリプシンを不活性化する血清を含むM2培地5mlを含む15 mlの遠心チューブに細胞を移す。 5分間1000rpmで細胞を増殖培地を遠心分離。上清を吸引し、細胞のペレットをDPBS 5 mlを懸濁します。同じ条件で再びDPBS細胞を遠心分離します。再び上清を吸引し、CO 2の独立したメディアの500μlに細胞のペレットを再懸濁します。
重力駆動型フローを介してデバイスのマイクロ流路中心に種子細胞の得られた懸濁液を。それぞれ、細胞懸濁液60μlおよびCO 2非依存培地の20μlを持つマイクロチャネルセンターの入口と出口を追加。細胞接着を探すために明視野顕微鏡下でマイクロチャネルセンターを守ってください。細胞は通常10分後に付着する。細胞は適切な密度でチャネルの底部に付着した後、入口で、残りの細胞懸濁液と出口でメディアをpipeted。センターチャンネルの入口と出口の両方でCOの場所60μlの2 -独立系メディア。場所PDMSは、番目以上をカバーセンターチャンネルからのメディアの蒸発を最小限に抑えるために、電子センターの入口および出口。
撮像素子のセル
顕微鏡の気象観測所（オリンパスX81）を介して滅菌ルティックチューブスレッド、装置の組立に先立ちと蠕動ポンプ（ワトソン - マーロウ205U/CA）で接続します。 4 RPMの速度でチューブをPBSをフラッシュします。装置の組み立て後、15 ml遠心チューブ内のCO 2 -独立系メディアにおける上皮成長因子（EGF）（シグマ）ソリューションの適切な濃度を準備する。 5秒間ボルテックスEGFソリューションを、チューブで接続してください。デバイスに対応するEGF濃度が付いているチューブを接続します。 EGFは、チャネルの尾根を越え拡散し、安定した化学的勾配を確立するためのそれは約1時間かかります。
イメージングソフトウェア、Slidebookは、実験の実行で約5時間10分ごとに時の画像のセットを取得するために使用されます。 XY自動ステージは、このような2同一のセンターチャンネルのサブ領域（400μmx400μmの面積を持つ）、および3つの中心チャネルの合計にプログラムされている特定の時点で撮像する。チューブに記載されて別のセンターチャネル（通常、3一度の実行で）の細胞は、異なるEGF濃度を有する。
材料と機器
細胞株：C17.2細胞は出生後のマウスの小脳6,7の外部胚層から派生したのNSCです。この細胞株を使用して、我々はレトロウイルスのトランスフェクション法を使用して、2つの他のマウスの幹細胞株を開発した。これら二つの安定にトランスフェクトされた細胞株は、（1）wtEGFRです - ヒト野生型EGFRを過剰発現する、と（2）ΔEGFR - その構成的に活性EGFRの変異体である。検出の容易さのために、レトロウイルスは、リボソーム結合（IRES）および緑色蛍光タンパク質（GFP）のための内部サイトに続いて興味の遺伝子を持つバックボーンを運ぶ。
細胞培養：マウスC17.2のNSCとその変種が10％ウシ胎児血清（FBS）（インビトロジェン社）とM2培地（DMEM（Invitrogen社）、5％ウマ血清（HS）（Invitrogen社で6 -ウェルプレートで増殖させた）、および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社）。）細胞は、80％空気、5％CO 2で37℃に維持した。
マイクロ流体デバイス：プラスチックマニホールド、PDMSのスペーサー、所定の位置にデバイスを保持するためのステンレスフレーム。
イメージング
倒立蛍光顕微鏡（オリンパスIX - 81）が激化CCDカメラ（オルカ、浜松）に関連して、使用されています。マイクロ流体デバイスは、自動XYZステージ上に搭載され、そして舞台は37 o Cでの温度を維持し、環境チャンバーで囲まれている自動XYZステージを使用して、同じ時点で撮影される同チップ3-4デバイスが通常あります。
維持流量
オートはシンクとソースのチャンネルのすべてのフローを維持するために使用される8本の平行線（ワトソン - マーロウ205U/CA）と蠕動ポンプ。
図。 1様々なEGF濃度の三NSC株（親、wtEGFR、およびD EGFR）の運動はすべて軌道が5時間の映画を追跡から取得されます（wtEGF 100ng/mlの、4hourを除く）、およびすべてのトラックの原点があった比較のために（0,0）で再配置。
図。 EGFRの発現レベルと運動性の2相関 （）100ng/mlのEGFとマイクロ流体チャネルの表面上にwtEGF NSCの二つの画像。 左の画像は、蛍光画像であり、右が送信される明視野像である。 スケールバーは100μmのです、と チャネル幅は400μmである。 細胞は、発現したGFPの明るさによって2つの集団に分けられています。 細胞 青い円は調光器ですで、このように少ないEGFR発現のレベルを持っていると、赤の円内のセルはbrigherです、したがって、より高いEGFRの発現レベルを持っている。低および高EGFRの発現レベルと細胞の（b）の軌道。これらの軌道は4時間の映画から取られます。
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Discussion
図。 1は3つのNSC株、親細胞、wtEGFRとΔEGFR（コントロール）の軌跡を示しています。軌跡の各セットは、5時間の長い映画から得た。 EGFの濃度は〜10ng/mlだったとき、親の細胞の場合は、細胞の運動性は、ピーク、wtEGFR細胞について、細胞運動のピークは100ng/mlのまたは上記にシフトし、期待通りにΔEGFR細胞について、細胞の運動性は、EGFの濃度とは独立していた。
100ng/mlの持つwtEGF細胞はほとんどの運動性細胞である、彼らは約1.5倍の速さ10ng/mlと親細胞より移動。これは、（1）EGFRの過剰発現細胞の運動性を高めることを示し、（2）EGFリガンド - 受容体のbidingイベントの数は、細胞の運動性に直接影響を与えます。 ΔEGFRの細胞株では恒常的に活性化EGFRの変異体である。この変異体は、ヒト神経膠芽腫の約60％で表示されます。それは、恒常的活性リガンド非依存性キナーゼになった切り捨て細胞外ドメインを持っています。自己リン酸化の強さは、野生型EGFR（wtEGFR）4活性化リガンドと比較して（約10％）小さくなります。この根底にΔEGF細胞は親とwtEGFR（EGFの存在下で）よりわずかに高い運動性を持っているが、運動性は、様々なEGFの濃度で一定に保たれていることを観察。
wtEGFR細胞はGFP（緑色蛍光タンパク質）とEGFRの同じコピーを行うので、wtEGFR細胞の蛍光強度は、EGFRの発現レベルを明らかにする。これは、私たちは直接細胞の運動性とEGFR蛋白発現のレベルを（緑色蛍光強度）相互に関連付けることができます。図。赤い円の2つの細胞集団の軌跡、細胞は明るい2に示すように、このように高いEGFRの発現レベルを持っている、そして、青丸の細胞は夕食である、従ってより低いEGFRの発現レベルを持っています。結果は、再び高いEGFRの発現レベルが、より多くの運動性、これらの細胞があることを示している。
伝統的に、NSCの運動性は膜を通って移行する細胞の割合が5を評価する場合、Boydenチャンバーアッセイを用いて決定されている。これは、細胞の挙動を個別に評価することができない人口ベースのアッセイ、です。ここに示されているマイクロ流体デバイスは、単一細胞レベルで、そして十分に制御された化学物質の環境における細胞の動きを勉強する機会を提供します。それは生きている細胞のNSCの運動性の表現型と直接EGFRの蛋白質の発現レベルを関連付けるために、初めて、ものをすることができます。デバイスの小さなサイズは、ヒト幹細胞などの細胞源が限られている実験の場合に特に便利です。
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Acknowledgments
この作品は、科学、技術及び学術研究（NYSTAR）（先端技術助成のためのセンターの形で）、のニューヨーク州事務所でとナノバイオテクノロジーセンター（NBTC）、ナショナルのSTCプログラムからの補助金によってサポートされています契約書第ECS - 9876771の下で科学財団、およびアメリカの脳腫瘍協会と医学のニューヨークアカデミー（JAB）。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
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