Summary
ويمكن دراسة ديناميات القشرية تدفق الدم في الجسم الحي بواسطة الأصباغ الفلورية التصوير ديكستران تحقن في الوريد مع ذيل القوارض 2 - الفوتون المجهري. هذا الفيديو يوضح كيفية ديناميات صورة تدفق الدم في اللحاء الجديد من الفئران من خلال زجاج النافذة المغطاة إعداد الجمجمة.
Abstract
القدرة على صورة الأوعية الدموية الدماغية (من السفن الكبيرة إلى الشعيرات الدموية) ، وديناميات سجل تدفق الدم في الدماغ سليمة من القوارض الحية هي تقنية قوية. تستخدم في الجسم الحي 2 - الفوتون المجهري من خلال نافذة الجمجمة فمن الممكن أن الأصباغ الفلورية صورة حقن في الوريد. هذا يسمح احد لصورة الأوعية الدموية القشرية ، وكذلك للحصول على قياسات تدفق الدم. وقد تم تطوير هذه التقنية أصلا من قبل ديفيد كلاينفيلد وينفريد Denk. ويمكن استخدام أسلوب لدراسة ديناميكية تدفق الدم أثناء أو بعد نقص التروية الدماغية ، والاضطرابات العصبية ، وأورام الدماغ ، أو في علم وظائف الأعضاء الدماغ العادي. على سبيل المثال ، تم استخدامها لدراسة كيفية السكتة الدماغية أسباب التحولات في اتجاه تدفق الدم والتغيرات في سرعة الدم الحمراء خلية أو التمويه في وحول احتشاء. نحن هنا لشرح كيفية استخدام 2 الفوتون المجهري لصورة ديناميكية تدفق الدم في اللحاء الجديد من الفئران الحية باستخدام الأصباغ الفلورية حقنها في الوريد الذيل.
Protocol
حقن الوريد ذيل الأصباغ الفلورية dextrans
- من أجل صورة الأوعية الدموية الدماغية ، لا بد من حقن الحيوانات عن طريق الوريد مع صبغة الفلورسنت. نستخدم ديكستران - مترافق الأصباغ لأن شاردة ديكستران يمنع الصبغة من عبور حاجز الدم في الدماغ وتسرب في الأوعية الدموية.
- الفئران هي تخدير مع isoflurane (4 ٪ لتحريض ، 1،5-2 ٪ خلال الحقن).
- وتطهيرها الذيل مع الكحول 70 ٪.
- مع إبرة قياس 26 ، يتم حقن 75-100 ميكرولتر من حل V / V 5 ٪ من ديكستران رودامين المذاب في المياه المالحة عن طريق الوريد الذيل ، في منتصف الطريق على طول رمح الذيل.
- ويمكن تصوير الحيوانات مباشرة بعد حقن الوريد الذيل حتى تفرز الصبغة في البول ، والذي سيقوم بدوره الوردي في حالة استخدام صبغة رودامين في حوالي 2 ساعة.
تصوير تدفق الدم باستخدام اثنين من الفوتون المجهري (المدة الإجمالية 30-60 دقيقة لكل دورة ، اعتمادا على عدد من السفن المصورة)
- بعد حقن صبغة الفلورسنت دكستران ، الفأر هو تخدير مع isoflurane (4 ٪ لتحريض ، 1-1،5 ٪ للتصوير).
- ويرد بحزم الماوس باستخدام شريط التيتانيوم إلى مرحلة المجهر ، والذي يحتوي على وسادة التدفئة الحرارية التنظيم للحفاظ على الحيوانات دافئة. يتم تطبيق بعض مرهم العين للحفاظ على عينيه رطبة.
- يتم تنظيف الزجاج غطاء النافذة الجمجمة مع الكحول 70 ٪.
- يتم وضع إطار موازية لطائرة الوصل ، وتركزت في مجال الرؤية في إطار الهدف 4X.
- فمن الأفضل لالتقاط صورة للسفن السطح المخ مع كاميرا رقمية. وسيتم استخدام هذه الصورة كصورة مرجعية في الدورات التالية للعثور على التصوير تصوير المنطقة مرارا وتكرارا من يوم الى يوم.
- يتم استبدال الهدف 4X مع الماء الغمر 40X الهدف دون تحريك المرحلة. يتم أخذ صورة رقمية للمجال الرؤية من جديد. يتم تعيين إحداثيات تتلاعب في المرحلة صفر.
- نستخدم ScanImage كصورة اقتناء البرمجيات. وقد كتب هذا في Matlab بواسطة Pologruto توم وبرناردو ساباتيني في مختبر كاريل سفوبودا (Pologruto وآخرون ، 2003). ننتقل بعد ذلك على جميع المعدات الأخرى : ليزر ، والسلطة متر ، وأنابيب مضاعفات الصورة ، ومكبرات الصوت ، الخ.
- يتم تفحص المنطقة لفترة وجيزة من إطار مناسب ليمكن تصوير عند التكبير منخفضة للعثور على أفضل المناطق. حالما يتم تحديد هذه ، تضخم منخفضة كومة من المنطقة المختارة لأخذ الصورة ، ولها إحداثيات XY والمشروح.
- لتسجيل ديناميكية تدفق الدم في الأوعية الصغيرة أو الشعيرات الدموية التي نستخدمها على طول خط المسح لا يقل عن 40 ميكرون للسفينة من الفائدة. تتم هذه واحدة "الاحتلالات" دائم ثانية واحدة باستخدام الليزر كقوة أقل قدر ممكن ، وتتم كتابة الاحداثيات وزاوية مسح أسفل.
- مرة واحدة في دورة التصوير هو أكثر ، يتم نقل الحيوانات إلى الغرفة الدافئة حيث يمكن التعافي من التخدير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن دراسة ديناميات القشرية تدفق الدم في الجسم الحي بواسطة الأصباغ الفلورية التصوير ديكستران حقنها في الوريد ذيل القوارض مع اثنين من الفوتون المجهري. وأظهر هذا الفيديو وسيلة لكيفية صورة ديناميكية تدفق الدم في اللحاء الجديد من الفئران من خلال زجاج النافذة المغطاة إعداد الجمجمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD500S | mol wt 500,000 |
| Rhodamine B isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | R9379 | mol wt ~70,000 |
References
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
- Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).
