Summary
Kortikala blodflödet dynamik kan studeras in vivo genom avbildning fluorescerande dextran färgämnen injiceras i svansvenen av gnagare med 2-foton mikroskopi. Denna video visar hur man bilden blodflödet dynamik i neocortex möss genom en glastäckta kraniell fönster beredning.
Abstract
Förmågan att bilden av cerebral kärlsystemet (från stora fartyg till kapillärerna) och spela in blod dynamik flödet i den intakta hjärnan hos levande gnagare är en kraftfull teknik. Med in vivo-2-foton mikroskopi via en kraniell fönster är det möjligt att bilden fluorescerande färger injiceras intravenöst. Detta tillåter en att bilden kortikala kärlsystemet och också få mätningar av blodflödet. Denna teknik utvecklades ursprungligen av David Kleinfeld och Winfried Denk. Metoden kan användas för att studera dynamiken blodflöde under eller efter cerebral ischemi, i neurodegenerativa sjukdomar, i hjärntumörer, eller i hjärnans normala fysiologi. Till exempel har den använts för att studera hur stroke orsakar förändringar i blodflödet riktning och förändringar i röda blodkroppar hastighet eller flöde i och kring infarkt. Här kan vi visa hur man använder 2-foton mikroskopi flöda bild blod dynamiken i hjärnbarken på levande möss med fluorescerande färgämnen injiceras i svansvenen.
Protocol
Svansvenen injektioner av fluorescerande dextraner färgämnen
- För att bilden cerebral kärlsystemet skall djuren injiceras intravenöst med fluorescerande färg. Vi använder oss av dextran-konjugerade färgämnen eftersom dextran fraktion hindrar färgen från att korsa barriären hjärnan blod och läcker ut från blodkärlen.
- Möss är sövda med isofluran (4% för induktion, 1,5-2% under injektion).
- Svansen är desinficeras med 70% alkohol.
- Med en 26 gauge kanyl, är 75-100 ìl av en 5% v / v lösning av Rhodamine dextran löst i saltlösning injiceras genom den svansvenen, halvvägs längs axeln av svansen.
- Djur får avbildas direkt efter svansvenen injektion tills färgen utsöndras i urinen, vilket kommer att bli rosa om du använder en Rhodamine färg i ca 2 timmar.
Avbildning av blodflödet med hjälp av två-photon mikroskopi (total varaktighet 30-60 min per tillfälle, beroende på antalet avbildade fartyg)
- Efter fluorescerande dextran färg injektion musen sövda med isofluran (4% för induktion, 1-1,5% för imaging).
- Musen är ordentligt fastsatt med titan bar till mikroskop scenen, som innehåller en termo-reglerad värmedyna för att hålla djuret varmt. Vissa ögonsalva appliceras för att hålla ögonen fuktiga.
- Den skyddsglas av kraniala fönster rengörs med 70% alkohol.
- Fönstret är placerad parallellt med fokalplanet och centrerad i synfältet under 4X målet.
- Det är bäst att ta ett fotografi av fartyg hjärnans yta med en digitalkamera. Denna bild kommer att användas som bilden av hänvisningen i följande avbildning sessioner för att hitta den avbildade området upprepade gånger från dag till dag.
- Det 4X Målet ersätts med nedsänkning i vatten 40X objektiv utan att flytta scenen. En digital bild av synfältet tas igen. Koordinaterna i det skede manipulatorn sätts till noll.
- Vi använder ScanImage som bilden förvärvet programvara. Detta skrevs i Matlab av Tom Pologruto och Bernardo Sabatini i laboratorium av Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Vi vänder nästa på all annan utrustning: lasern, den kraftmätare bilden multiplikatorer rör, förstärkare, etc.
- Området i fönstret passar att avbildas är kort skannas vid låg förstoring för att hitta de bästa regionerna. När dessa är identifierade, en låg förstoring bunt med den valda regionen att bilden tas, och dess XY-koordinater kommenterad.
- För att spela dynamik blodflödet i små kärl eller kapillärer vi använda linje skannar tillsammans minst 40 ìm av fartyget av intresse. Dessa singel "sveper" varaktig en sekund är klar med så lite laser ström som möjligt och koordinater och vinkel skanning skrivs ned.
- När imaging sessionen är över, är djuret flyttas till en varm kammare där den kan återhämta sig från narkosen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortikala blodflödet dynamik kan studeras in vivo genom avbildning fluorescerande dextran färgämnen injiceras i svansvenen av gnagare med två-photon mikroskopi. Denna video visar en metod för hur man bilden blodflödet dynamik i neocortex möss genom en glastäckta kraniell fönster beredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD500S | mol wt 500,000 |
| Rhodamine B isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | R9379 | mol wt ~70,000 |
References
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
- Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).
