Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Summary

Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.

Abstract

Obtención de imágenes ópticas (OI) es una herramienta fácil, rápida y económica para monitorización in vivo de las nuevas terapias con células madre basado. La técnica se basa en el etiquetado ex vivo de células madre con un tinte fluorescente, la inyección intravenosa posterior de las células marcadas y la visualización de su acumulación en órganos específicos o patologías. La técnica presentada demuestra la forma en que la etiqueta de células madre mesenquimales (hMSC) por simple incubación con el colorante fluorescente lipofílicas DID (C67H103CIN2O3S) y la forma en que la etiqueta de células madre embrionarias (células madre) con la FDA aprobó el colorante fluorescente verde de indocianina (ICG). El mecanismo de captación es a través de la adhesión y difusión del colorante lypophilic a través de la bicapa de fosfolípidos de membrana celular. El etiquetado de eficiencia suele mejorar si se incuban las células con el colorante en el medio libre de suero en lugar de incubación en el suero que contienen los medios de comunicación. Además, la adición del sulfato de protamina agente de transfección mejora significativamente la absorción del agente de contraste.

Protocol

Etiquetado de las células madre mesenquimales con el colorante fluorescente SABÍA

1. Para comenzar el procedimiento para el etiquetado de las células madre mesenquimales, trypsinize y el recuento de las células para obtener una suspensión con un número determinado de células.
2. Tomar las células de la incubadora y aspirar a los medios tradicionales de los frascos que contienen las células que ser etiquetados
3. Se lavan las células con 10 ml de Mg / Ca libre de PBS. Aspirar el PBS. El Mg y Ca inhibiría la tripsina, por lo que el uso de PBS sin estos.
4. Añadir precalentado tripsina 0,05%, para un frasco T75 usamos 5 ml. Asegúrese de que toda la superficie del frasco está cubierto.
5. Se incuba a 37 ° C en la incubadora durante unos 5 minutos.
6. Confirmar la separación bajo el microscopio. Si las células todavía se adhieren a la botella, que toca un par de veces y esperar un poco más hasta que la tripsina tiene éxito.
7. Ahora, es necesario para neutralizar la tripsina mediante la adición de los medios de comunicación que contiene 10% de FCS. Utilizamos la misma cantidad de medios de comunicación como es la tripsina.
8. Pipeta hacia arriba y abajo varias veces para asegurarse de que todas las células se vuelven a suspender en los medios de comunicación.
9. La transferencia de la solución de células a un tubo estéril de polipropileno 15 ml tapado.
10. Centrifugar a 400 rcf durante 5 minutos.
11. Aspirar el sobrenadante asegurando de no perturbar el sedimento celular.
12. Resuspender las células en DMEM y proceder con el recuento de células.
13. Suspender las células para ser etiquetados con una densidad de 1x10 ^ 6 por ml en medio de cultivo libre de suero (DMEM).
14. Todo esto fue la preparación de la suspensión celular. Ahora, está listo para iniciar el etiquetado.
15. En primer lugar, añadir 5 l de medio de contraste SABÍA por ml de suspensión celular.
16. A continuación, mezclar la solución pipeteando con suavidad.
17. Se incuban las células con la solución de etiquetado a 37 ° C durante 20 minutos en un 6-y de bajo apego plato.
18. Una vez que el simple incubación es completa, es necesario para transferir la solución de células a un tubo de polipropileno de 15 ml tapado.
19. Centrífuga hacia abajo a 400 rcf durante 5 minutos.
20. Aspirar el medio de etiquetado, que garantizan no perturbar el sedimento celular.
21. Lavan las células con PBS. Pipeta las células arriba y hacia abajo, asegurándose de que para romper el pellet de células.
22. Repita los dos últimos pasos dos veces más, así que hay un total de 3 etapas de lavado.
23. Contar las células y realizar una prueba de azul tripán para determinar la viabilidad celular. Estos son los protocolos estándar de cultivo celular que no vamos a explicar aquí.
24. Sus células están listos para ser captado en imágenes ópticas.

Etiquetado de células madre embrionarias humanas con el tinte fluorescente ICG

1. Para comenzar el procedimiento para el etiquetado de células madre embrionarias humanas, prepare el agente de contraste verde de indocianina. Se mezcla con la protamina agente de transfección.
2. Mida 1 mg de polvo verde de indocianina. Disolver el polvo de ICG en 100 l de dimetilsulfóxido (DMSO).
3. Añadir 400 l de Dulbecco modificado Eagles Medium (DMEM + 10% Becerro de suero fetal) los medios de comunicación a la mezcla y agite bien. Esto da lugar a una concentración final de 2mg/ml de verde de indocianina.
4. Añadir la protamina agente de transfección. Protamina actúa como lanzadera para el agente de contraste, por lo que entra en la célula de manera más eficiente.
5. Mezcla de sulfato de 5 l de protamina, que se suministra a una concentración de 10mg/ml, con 300 l ICG y 300 l de suero libre de medio Dulbecco modificado Eagles.
6. Agite con cuidado la solución de transfección nuevo durante 5 minutos para permitir complejos de forma.
7. La solución de etiquetado está listo.
8. Aspirar a los medios tradicionales de células madre de 10 mm placa de Petri.
9. Añadir 5 ml de pre-calentado suero libre de DMEM.
10. Añadir la solución previamente preparada de protamina / ICG a las células. Iniciar la incubación de una hora colocando la cápsula en una incubadora a 37 ° C.
11. Después de la incubación, retire el plato de la incubadora y aspirar a la solución de etiquetado.
12. Lavar las células de un enjuague el plato con 5 ml de PBS.
13. Aspirar el PBS y reemplazar con 5 ml de tripsina 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C durante 5 minutos para permitir que tripsinización a ocurrir. Esto ayuda a sacudir el plato un poco de vez en cuando.
14. Pipeta suavemente hacia arriba y abajo, para romper las colonias restantes.
15. Neutralizar la tripsina mediante la adición de una cantidad igual de KSR al plato.
16. La transferencia de la solución de células a un tubo de 15 ml y centrifugar la solución a 400 rcf durante 5 minutos.
17. Resuspender las células en los medios de comunicación completa.
18. Si todavía hay grupos en este punto, trypsinize y centrifugar de nuevo.
19. Una vez que un grupo sin solución de células se logra, aspirar a los viejos medios y resuspender el precipitado en 10 ml de pre-calentado completo los medios de comunicación ESC.
20. En este punto, es necesario separar las células de alimentación de ratones de la hESCs. Esto se hace para asegurar que, más tarde, sólo imágenes de las células madre se produce.
21. Para ello, la transferencia de the solución de células a un plato de gelatina recubierto de 10 cm.
22. Coloque el plato en la incubadora a 37 ° C y dejar que repose durante 45 minutos. Durante este tiempo, asegúrese de no perturbar el plato. Ahora, los alimentadores se adhiere a la cápsula y las células madre no.
23. Transferir la solución de la placa de Petri. y ahora tenemos una solución de etiquetado células individuales de células madre embrionarias humanas.
24. Las células ahora se puede contar y una prueba de azul tripán se pueden realizar en ellos.
25. Las células están listos para ser fotografiado!

Discussion

La osteogénesis imperfecta es una técnica relativamente nueva de imágenes, basado en la detección de la fluorescencia. La osteogénesis imperfecta es más sensible que las técnicas de imagen radiotrazador basado en, pero no se asocia con cualquier exposición a la irradiación. OI es un medio eficaz de seguimiento de las células de forma no invasiva y repetitiva, lo que ofrece información para la migración de células al sitio de destino. Una de las principales limitaciones de la técnica es la penetración en el tejido limitado de sondas fluorescentes en vivo. Por lo tanto, una acumulación del trazador en los tejidos profundos, más de unos 5-10 cm de la superficie de la piel, pueden no ser detectados. Actuales aplicaciones clínicas se limitan a las técnicas superficiales, tales como endoscopia, cardiovascular y retinas de imágenes (Funovics et al. 2003), pero este campo de la investigación continuará expandiéndose a través del reconocimiento de las amplias posibilidades que ofrece en el seguimiento de células in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Biosciences	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners