Summary
Questo video mostra il processo di registrazione di tensione a cellula intera pinza nella fetta della retina della tigre salamandra acquatica. Dimostriamo la preparazione della fetta e come effettuare registrazioni di patch clamp durante la stimolazione visiva della retina.
Abstract
Usiamo la cellula intera tecnica di patch clamp per lo studio dei circuiti sinaptici che sottende l'elaborazione delle informazioni visive nella retina. In questo video, vi guiderà attraverso il processo di esecuzione a cellula intera registrazioni di luce correnti evocato delle singole cellule nella preparazione fetta della retina. Usiamo il acquatici tigre salamandra come un modello animale. Cominciamo con la descrizione della dissezione degli occhi e mostrare come le fette sono montati per le registrazioni elettrofisiologiche. Una volta che la fetta si trova nella camera di registrazione, dimostriamo come eseguire a cellula intera registrazioni clamp di tensione. Abbiamo poi progetto stimoli visivi sul fotorecettori nella fetta di suscitare luce evocata attuali risposte. Durante la registrazione abbiamo profumato la fetta con agenti farmacologici, per cui un sistema a 8 canali perfusione ci permette di passare velocemente tra diversi agenti. La preparazione fetta della retina è ampiamente usato per le registrazioni di patch clamp nella retina, in particolare per studiare amacrine e cellule bipolari, che non sono accessibili in un tutto-mount preparazione.
Protocol
Soluzioni
- Soluzione intracellulare di cellule gangliari (in mm): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM solforodamina B (per la colorazione), portato a pH = 7,4 con KOH
- Soluzione intracellulare di cellule bipolari (in mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 Bapta, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM solforodamina B (per la colorazione), portato a pH = 7,4 con KOH
- Ringer extracellulare della soluzione (in mm): 112 NaCl, 5 Glucosio, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, portato a pH = 7.75 con NaOH. Ossigenazione della soluzione non è necessario.
Preparare camere di registrazione
La nostra camera di registrazione è costituito da un vetrino da microscopio con un adesivo ben in cui blocchi di silicone piccolo ritagliato da un altro adesivo e sono in grado di dare stabilità al fette di tessuto.
Preparazione di fette della retina
Per evitare lo sbiancamento dei fotorecettori, la dissezione viene effettuata in IR o luce fioca luce rossa. Se uno è interessato a registrare le risposte dal sentiero asta, solo luce IR deve essere usato (IR dissezione microscopio e nessuna luce ambiente. Aggiuntive occhiali a infrarossi devono essere utilizzati per le procedure non fanno sotto il microscopio). Se uno è principalmente interessato a registrare le risposte cono di luce, fioca luce della stanza rossa o una luce del flash rosso può essere utilizzato. Il microscopio, tuttavia, deve ancora oculari IR.
Se l'ingresso dei fotorecettori è irrilevante per l'esperimento, le procedure possono essere effettuate in luce ambiente normale utilizzando un microscopio normale.
- Preparare due vetrini da microscopio con un adesivo siliconico bene: creare due bande parallele di grasso al silicone (circa 0,5 centimetri di distanza) in ogni diapositiva e luogo un pezzo rettangolare di carta da filtro su un lato del vetrino, attraversando entrambe le bande grasso (spingere il filtro carta con parte di una lama di rasoio in modo che sia ben collegato alla diapositiva)
- Sacrificare una salamandra secondo i protocolli stabiliti: l'animale viene posto in un bagno di ghiaccio per 30 minuti, poi decapitato e doppio pithed.
- Eliminare l'effetto occhi dalla testa salamandra e metterla sotto il microscopio da dissezione su un pezzo di carta velina inumidita con soluzione ghiacciata di Ringer
- Rimuovere il tessuto connettivo dall'occhio
- Usa lama di rasoio per fare un piccolo taglio nella cornea
- Tenere taglio della cornea con una pinza, mentre la rimozione con le forbici lungo il suo attaccamento per l'occhio
- Rimuovere l'obiettivo con una pinza
- Tenere l'iride con una pinza e taglio lungo la serrata per rimuovere l'iride
- Tagliare l'oculare in due pezzi rettangolari
- Prendete uno dei pezzi e mettetelo lato sclera sul filtro di carta (assicuratevi di appiattirsi il pezzo mentre si spinge verso il basso con molta attenzione)
- Sollevare delicatamente la sclera al largo della retina, che ora dovrà essere allegata alla carta filer
- Aggiungere rapidamente una soluzione ghiacciata di Ringer al pozzo
- Ripetere lo stesso per il secondo pezzo
- Utilizzare una lama di rasoio posto in una affettatrice su misura per tagliare 200-300μm fette larghe.
- Usare un paio di pinze per prendere le fette a lato della carta da filtro, li girare così gli strati della retina diventano visibili, e metterli su bande grasso il vuoto
- Scegli una fetta che sembra intatto e mostra fasce orizzontali che indicano gli strati della retina (i livelli sono a volte difficili da vedere al microscopio dissezione come l'ingrandimento non è abbastanza alta, se si può riconoscere qualche stratificazione la fetta di solito è abbastanza buono. La decisione finale sull'opportunità di utilizzare la fetta, comunque, è fatta una volta si è vista al microscopio in posizione verticale). Spostare alla diapositiva camera di registrazione con la costruzione di un ponte Ringer tra i due vetrini
- Assicurarsi che la carta da filtro viene spinto contro i blocchi di gomma nella camera di registrazione in modo che la fetta non sia inclinato (cellule gangliari e fotorecettori dovrebbe essere a fuoco allo stesso tempo)
Posizionamento del tessuto nel rig registrazione
- La slitta di registrazione è posto sotto il microscopio e perfusi con soluzioni di Ringer attraverso un syste perfusione gravità
- La preparazione è visualizzato con un microscopio verticale con un obiettivo 10x e 40x acqua ad immersione.
- Ancora una volta, usiamo solo la luce a infrarossi per prevenire lo sbiancamento dei fotorecettori. Una telecamera a infrarossi è collegato alla porta laterale del microscopio, che è collegato ad uno schermo TV.
Stimolazione visiva
Stimoli visivi sono programmati in Matlab utilizzando la Psychtoolbox e vengono proiettate sulla retina attraverso la porta superiore del microscopio utilizzando un microscopio immagine iniettore (MBF bioscienze). A Bits + + processore video digitale (Cambridge Research Systems) è usato per ottenere una scala a 14 bit di luminanza e di sincronoonize presentazione dello stimolo con l'acquisizione dei dati. Gli stimoli visivi utilizzati in questo video sono barre chiare o scure (width = 460μm) del 100% di contrasto, che sono stati presentati per due secondi su uno sfondo uniforme costante (luminanza = 8 * 10 4 fotoni / micron / s, dimensioni: 1,84 x 1,38 millimetri).
Elettrofisiologia
- Elettrodi di patch sono tirati da vetro borosilicato (OD:.. 1,5 mm, ID 84mm) con un estrattore micropipetta. Per le cellule gangliari, le resistenze sono tra 2 e 4 MOhm. Per le cellule bipolari, più resistenze tra 4 e 8 MOhm sono utilizzati.
- Registrazioni morsetto di tensione sono eseguiti utilizzando una 700A Multiclamp (Molecular Devices), un amplificatore e software laboratorio interno programmato in Labview.
- I farmaci sono perfusi attraverso un sistema a 8 canali perfusione. L'elettrodo microperfusione si trova vicino alla fetta (il tessuto dovrebbe visibilmente muoversi quando si accende la perfusione e fuori, ma bisogna stare attenti che la pressione non è troppo forte in modo che la fetta potrebbero staccarsi dalla carta da filtro). Durante gli esperimenti il microperfusione deve essere costantemente acceso (soluzione di controllo perfusione se non sono necessari farmaci) in modo che la registrazione non viene disturbato dal passaggio della perfusione e si spegne.
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Discussion
Vantaggi:
- Tutti i tipi di cellule sono accessibili
- Facile identificazione dei tipi di cellule, in particolare se un colorante fluorescente viene aggiunto alla soluzione elettrodo
- Agenti farmacologici possono facilmente raggiungere le cellule bersaglio
- La tecnica di patch clamp consente di indagare il ruolo dei canali ionici diversi nei calcoli della retina. Le stesse informazioni non possono essere ottenute attraverso le registrazioni extracellulare picco o registrazioni con elettrodi taglienti.
- Questa tecnica può essere applicata ad altri modelli animali
Svantaggi:
- Processi potrebbe avere tagliato nel processo di taglio. Pertanto, gli studi che si concentrano sul settore ricettivo spaziale potrebbe essere difficile.
- Come nella maggior parte della retina in preparati in vitro utilizzato per elettrofisiologia, l'epitelio pigmentato è stato rimosso, che può portare alla decolorazione dei fotorecettori. Gli studi che richiedono la stimolazione con luce ad alta intensità o di necessità di studiare la retina in molti stati l'adattamento potrebbe incorrere in difficoltà con questa tecnica.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
