Summary
Это видео показывает процесс цельноклеточная напряжения зажим записей в сетчатке глаза кусочек водной саламандры тигра. Мы демонстрируем подготовки срез, а также как выполнять записи патч зажим во время визуальной стимуляции сетчатки.
Abstract
Мы используем цельноклеточная патч зажим методика исследования синаптических схему, которая лежит в основе обработки визуальной информации в сетчатке. В этом видео, мы вас через процесс выполнения цельноклеточная записей света вызвало токов отдельных клеток в сетчатке подготовки срез. Мы используем водную тигра саламандры в качестве животной модели. Мы начнем с описания рассечение глаза и показать, как ломтики установлены для электрофизиологических записей. Как только часть находится в записи камеры, мы покажем, как выполнять цельноклеточная записи напряжения зажимом. Затем проект зрительных раздражителей на фоторецепторы в срезе, чтобы выявить световых вызвала текущие ответы. Во время записи мы заливать срез с фармакологическими препаратами, в результате чего 8-канальный перфузии система позволяет быстро переключаться между различными агентами. Сетчатки подготовки ломтик широко используется для записи патч зажим в сетчатке, в частности для изучения amacrine или биполярных клеток, которые не доступны в целом монтажа подготовки.
Protocol
Решения
- Внутриклеточное решение для ганглиозных клеток (в мм): 100 К-глюконат, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 АТФ, ГТФ 0,5, 90 мкМ Sulforhodamine B (для окрашивания), доводят до рН = 7,4 с КОН
- Внутриклеточное решение для биполярных клеток (в мм): 90 К-глюконат, 8 KCl, 1 2 MgCl, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 АТФ, ГТФ 0,5, 90 мкМ Sulforhodamine B (для окрашивания), доводят до рН = 7,4 с КОН
- Внеклеточный раствор Рингера (в мм): 112 NaCl, 5 Глюкоза, 5 HEPES, 2 KCl, CaCl 2 2, 1 MgCl 2, доводят до рН = 7,75 с NaOH. Оксигенация решение не является необходимым.
Подготовка записи камер
Наши записи камера состоит из стекло микроскопа с клей ямы, в которой маленькие блоки силиконовые вырезали из другой клей хорошо размещены, чтобы обеспечить стабильность на срезах тканей.
Подготовка сетчатки ломтиками
Чтобы избежать отбеливания фоторецепторов, вскрытие проводится в ИК или тусклым красным светом свет. Если кто-то заинтересован в записи ответов от стержня пути, только ИК-свет должен быть использован (ИК рассекает микроскоп и нет места свету. Дополнительные очки ИК должен быть использован для процедуры не делаются под микроскопом). Если кто-то главным образом заинтересованы в записи световой конус ответов, тусклый красный свет комнате или на красный свет вспышки может быть использован. Микроскопом, однако, все равно должны иметь ИК окуляров.
Если фоторецептор вход не имеет никакого значения для эксперимента, процедуры можно проводить в нормальных светлую комнату с помощью обычного микроскопа.
- Приготовьте два слайда микроскоп с силиконовый клей хорошо: создать две параллельные полосы силиконовой смазки (около 0,5 см друг от друга) на каждом слайде и место прямоугольный кусок фильтровальной бумаги на одной стороне слайда, пересечения и смазки полосами (нажмите фильтра бумага с частью лезвия, чтобы она хорошо прикреплены к слайд)
- Жертва саламандра в соответствии с установленными протоколами: животное помещается в ледяной бане в течение 30 минут, затем обезглавленное и дважды pithed.
- Удалить глаз с головы саламандр и поместите ее под микроскоп рассекает на папиросную бумагу смоченную раствором ледяной Рингера
- Удалить из соединительной ткани глаз
- Используйте лезвие, чтобы сделать небольшой разрез в роговице
- Держите сократить роговицы пинцетом, удаляя его с ножницами вдоль его привязанность к глазу
- Снимите объектив с щипцами
- Держите диафрагму пинцетом и разрезать вдоль Серрата ора для удаления диафрагмы
- Вырезать наглазник на две прямоугольные куски
- Возьмите одну из частей и поместить его склеры вверх на фильтровальной бумаге (не забудьте выровнять кусок, выдвигая его вниз очень аккуратно)
- Аккуратно поднимите склеры с сетчаткой, который теперь должен быть присоединен к системе хранения бумаги
- Быстро добавляют раствор ледяной Рингера к хорошо
- Повторите то же самое для второй части
- Используйте лезвие помещается в заказ слайсер сократить 200-300μm широкий ломтиками.
- Используйте пару щипцов, чтобы забрать срезов на стороне фильтровальной бумаги, переверните их так слоев сетчатки становятся видимыми, и разместить их на полосы вакуумной смазки
- Выберите часть, которая выглядит неповрежденным и показывает горизонтальные полосы с указанием слоев сетчатки (слои иногда трудно понять, под микроскопом, как рассечение увеличения недостаточно высока, поэтому если можно признать некоторые слои срез, как правило, достаточно хорошо. Окончательное решение о том, использовать ли ломтик, однако, сделано, когда он будет рассматриваться под прямой микроскоп). Переместите его в слайд камеры записи путем создания Ringer мост между двумя слайдами
- Убедитесь, что фильтровальная бумага толкнул резиновые блоки в записи камеры так, чтобы срез не наклонено (ганглиозных клеток и фоторецепторов должны быть в центре внимания в то же время)
Размещение ткани в записи установки
- Запись слайд помещается под микроскоп и перфузии растворами Рингера через систе перфузии тяжести
- Подготовка визуализируется с прямой микроскоп с 10х и 40х цель погружением в воду.
- Опять же, мы используем только инфракрасный свет для предотвращения отбеливания фоторецепторов. ИК камера крепится к боковой порт микроскоп, который связан с экрана телевизора.
Визуальной стимуляции
Визуальные стимулы программируются в Matlab использованием Psychtoolbox и проецируются на сетчатку через верхний порт микроскопом использованием микроскопии изображение инжектора (ФМС биологических наук). Биты + + Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) используется для получения 14-битный масштабе яркости и synchronize стимул презентации сбора данных. Зрительные стимулы, используемые в этом видео яркие или темные полосы (ширина = 460μm) 100% контраста, которые были представлены в течение двух секунд на устойчивом фоне равномерной (яркость = 8 * 10 4 фотонов / мкм / с, размер: 1,84 х 1.38mm).
Электрофизиология
- Патч электроды вытащил из боросиликатного стекла (OD:.. 1,5 мм, ID 84 мм) с съемник микропипетки. Для ганглиозных клеток, сопротивления от 2 до 4 МОм. Для биполярных клеток, выше сопротивлений между 4 и 8 МОм используются.
- Напряжение записи зажим выполняются с помощью Multiclamp 700А (Molecular Devices), усилитель и лаборатории внутреннее программное обеспечение запрограммировано в LabVIEW.
- Наркотики перфузии через 8-канальный перфузии системы. Microperfusion электрод помещается рядом с ломтиком (ткань должна заметно двигаться при включении перфузии и выключается, но нужно быть осторожным, чтобы давление не слишком сильна, чтобы часть могла оторваться от фильтровальной бумаге). В ходе экспериментов microperfusion должна быть постоянно включен (перфузии решение для управления, если никаких наркотиков не требуется), так что запись не получить обеспокоены переключения перфузии и выключается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества:
- Все типы клеток, которые доступны
- Легкая идентификация типов клеток, в частности, если флуоресцентный краситель добавляется в раствор электрода
- Фармакологические средства можно легко добраться до клеток-мишеней
- Техника патч зажим позволяет исследовать роль различных ионных каналов в сетчатке вычислений. Эта же информация не может быть получена через extracelluar записи шип или записей с острыми электродами.
- Эта техника может быть применена к другим моделям животных
Недостатки:
- Процессы могут получить отрезали в процессе нарезки. Таким образом, исследования, которые сосредоточены на пространственных рецептивного поля может быть затруднено.
- Как и в большинстве сетчатки в пробирке препараты, используемые для электрофизиологии, пигментным эпителием удаляется, что может привести к отбеливанию фоторецепторов. Исследования, которые требуют стимуляции с высокой интенсивностью света или необходимость изучения сетчатки при многих состояниях адаптации могут возникнуть трудности с этой техникой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
