Summary
Dieses Video zeigt den Prozess der whole-cell voltage clamp Aufnahmen in der Netzhaut Scheibe der aquatischen Tiger Salamander. Wir zeigen die Herstellung der Scheibe als auch, wie man Patch Clamp Messungen während visueller Stimulation der Netzhaut führen.
Abstract
Wir nutzen die whole-cell Patch-Clamp-Technik, um die synaptische Schaltungen, die zugrunde liegende visuelle Informationsverarbeitung in der Netzhaut zu untersuchen. In diesem Video werden wir Sie durch den Prozess der Durchführung Ganzzellableitungen des Lichts hervorgerufen Ströme der einzelnen Zellen in der Netzhaut schneiden Vorbereitung leiten. Wir nutzen die aquatische Tiger Salamander als Tiermodell. Wir von der Beschreibung der Dissektion des Auges beginnen und zeigen, wie Scheiben für elektrophysiologische Aufzeichnungen sind montiert. Sobald die Scheibe in der Aufnahme Kammer gegeben ist, zeigen wir, wie man whole-cell voltage clamp Aufnahmen durchzuführen. Wir projizieren visuelle Reize auf die Photorezeptoren in der Scheibe, um Licht hervorgerufene aktuelle Antworten zu entlocken. Während der Aufnahmen haben wir versorgen die Scheibe mit pharmakologischen Mitteln, wobei eine 8-Kanal-Perfusion-System ermöglicht es uns, schnell zwischen verschiedenen Agenten zu wechseln. Die Netzhaut Scheibe Vorbereitung ist weithin bekannt für Patch Clamp Messungen in der Netzhaut, insbesondere auf amakrinen oder bipolare Zellen, die nicht zugänglich sind in einer ganzen-mount Vorbereitung zu studieren.
Protocol
Lösungen
- Intrazelluläre Lösung für Ganglienzellen (in mm): 100 K-Gluconat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 uM Sulforhodamine B (für die Färbung), auf pH = 7,4 mit angepassten KOH
- Intrazelluläre Lösung für bipolare Zellen (in mm): 90 K-Gluconat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 uM Sulforhodamine B (für die Färbung), auf pH = 7,4 mit angepassten KOH
- Extrazelluläre Ringer-Lösung (in mM): 112 NaCl, 5 Glucose, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, eingestellt auf pH = 7,75 mit NaOH. Oxygenierung der Lösung ist nicht notwendig.
Bereiten Sie die Aufnahme Kammern
Unsere Aufnahme Kammer besteht aus einem Mikroskop-Objektträger mit einem Klebstoff auch in die kleinen Silikon-Blöcke aus einem anderen Klebstoff schneiden gut aufgestellt, um Stabilität für die Gewebeschnitte Verfügung zu stellen.
Vorbereitung der Netzhaut Scheiben
Um zu vermeiden, Bleichen der Photorezeptoren ist die Zerlegung in IR-oder dim rotes Licht Licht durchgeführt. Wenn man interessiert sich für die Aufnahme Antworten von der Stange Weg, sollte nur IR-Licht verwendet (IR Präpariermikroskop und kein Licht ausgesetzt wird. Zusätzlicher IR-Brillen für Verfahren unter dem Mikroskop nicht getan werden sollte verwendet werden). Wenn man vor allem in der Aufnahme Kegel Licht Reaktionen, dim red room Licht oder eine rote Blitzlicht interessiert ist, kann verwendet werden. Das Mikroskop sollte jedoch noch IR Okulare.
Wenn Photorezeptor-Eingang ist irrelevant für das Experiment, können Verfahren, die in normalen Raumbeleuchtung durchgeführt werden mit einem normalen Mikroskop.
- Bereiten Sie zwei Objektträger mit einem Kleber Silikon gut: Erstellen Sie zwei parallele Bänder von Silikonfett (etwa .5 cm Abstand) auf jeder Folie und platzieren Sie ein rechteckiges Stück Filterpapier auf einer Seite der Folie, wo sowohl Fett-Bands (drücken Sie den Filter Papier mit einem Teil einer Rasierklinge so dass es gut ist, um die Folie im Anhang)
- Sacrifice ein Salamander nach festgelegten Protokollen: Das Tier ist in einem Eisbad für 30 Minuten gelegt, dann enthauptet und doppelklicken pithed.
- Entfernen Auge von Salamander Kopf und legen Sie sie unter dem Binokular auf ein Stück Seidenpapier angefeuchtet mit eiskaltem Ringer-Lösung
- Entfernen Sie das Bindegewebe aus dem Auge
- Verwenden Sie Rasierklinge einen kleinen Schnitt in der Hornhaut machen
- Halten Sie schneiden Hornhaut mit einer Pinzette entfernen, während sie mit einer Schere entlang der Bindung an das Auge
- Nehmen Sie das Objektiv mit einer Pinzette
- Halten Sie die Blende mit einer Pinzette und schneiden entlang der ora serrata, um die Iris zu entfernen
- Schneiden Sie die Augenmuschel in zwei rechteckige Stücke
- Pick-up eines der Stücke und legen Sie sie Sklera nach oben auf das Filterpapier (stellen Sie sicher, abzuflachen das Stück während Sie es sich sehr genau)
- Heben Sie die Lederhaut vor der Netzhaut, die nun sollte dem Filterpapier befestigt werden
- Schnelles Hinzufügen von eiskalter Ringer-Lösung, die auch
- Wiederholen Sie das gleiche für das zweite Stück
- Verwenden einer Rasierklinge in einem speziell angefertigten Allesschneider bis 200-300 pm breite Scheiben schneiden platziert.
- Verwenden Sie eine Pinzette zur Aufnahme der Scheiben an der Seite des Filterpapiers, schalten Sie sie so, dass die Schichten der Netzhaut sichtbar, und sie auf die Vakuum-Fett-Bands
- Wählen Sie ein Slice, das unbeschädigt aussieht und zeigt horizontale Streifen zeigt die Schichten der Netzhaut (die Schichten sind manchmal schwer zu unter Dissektionsmikroskop zu sehen, wie die Vergrößerung ist nicht hoch genug, aber wenn man einige Schichtung erkennen kann, die Scheibe ist in der Regel gut genug. Die endgültige Entscheidung darüber, ob die Scheibe zu verwenden, jedoch wird, wenn es unter dem aufrechten Mikroskop betrachtet wird). Move it, um die Aufnahme Kammer gleiten durch den Bau einer Ringer Brücke zwischen den beiden Folien
- Stellen Sie sicher, das Filterpapier gegen die Gummi-Blöcke in der Aufnahme Kammer geschoben, so dass die Scheibe nicht gekippt (Ganglienzellen und Photorezeptoren sollte im Fokus zugleich sein)
Platzierung des Gewebes in der Aufnahme rig
- Die Aufnahme Folie unter das Mikroskop gelegt und perfundierten mit Ringer-Lösungen durch eine Schwerkraft Perfusion syste
- Die Zubereitung ist sichtbar mit einem aufrechten Mikroskop mit 10x und 40x Wasserimmersionsobjektiv.
- Auch hier verwenden wir nur IR-Licht, um zu verhindern das Ausbleichen der Photorezeptoren. Ein IR-Kamera ist an den seitlichen Anschluss des Mikroskops, die zu einem TV-Bildschirm angeschlossen ist angebracht.
Visuelle Stimulation
Visuelle Reize werden in Matlab mit dem Psychtoolbox programmiert und sind auf die Netzhaut durch den oberen Anschluss des Mikroskops mit Hilfe eines Mikroskopie Bild Injektor (MBF bioscience) projiziert. A Bits + + Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) verwendet, um eine 14bit Leuchtdichte Maßstab zu erhalten und Synchronisationsspgonize Stimulus Präsentation mit Datenerfassung. Die visuelle Reize in diesem Video verwendet werden helle oder dunkle Balken (width = 460μm) von 100% Kontrast, der für zwei Sekunden auf einem stabilen einheitlichen Hintergrund (vorgestellt Luminanz = 8 * 10 4 Photonen / um / s, Größe: 1,84 x 1.38mm).
Elektrophysiologie
- Mit einer Mikropipette puller: Patch-Elektroden sind aus Borosilikatglas (.. 1,5 mm, ID 84mm OD) gezogen. Für Ganglienzellen sind Widerstände zwischen 2 und 4 MOhm. Für bipolare Zellen, sind höhere Widerstände zwischen 4 und 8 MOhm verwendet.
- Voltage Clamp-Aufnahmen sind mit Hilfe einer Multiclamp 700A (Molecular Devices), Verstärker-und Labor-interne Software in LabVIEW programmiert.
- Drogen sind durch einen 8-Kanal-Perfusion System perfundiert. Die Mikroperfusion Elektrode liegt in der Nähe der Scheibe (das Gewebe sollte sichtbar bewegt, wenn Sie die Durchblutung ein-und ausschalten, aber man muss vorsichtig sein, dass der Druck nicht zu stark, so dass die Scheibe könnte sich lösen von dem Filterpapier) gestellt. Bei Versuchen der Mikroperfusion sollte ständig eingeschaltet sein (Perfusion Control-Lösung, wenn keine Medikamente benötigt werden), so dass die Aufzeichnung nicht durch Einschalten der Perfusion und Ausschalten gestört.
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Discussion
Vorteile:
- Alle Zelltypen sind zugänglich
- Leichte Identifikation von Zelltypen, insbesondere wenn ein Fluoreszenzfarbstoff an die Elektrode zugesetzt
- Pharmakologische Wirkstoffe leicht zu erreichen Zielzellen
- Die Patch-Clamp-Technik erlaubt es, die Rolle der verschiedenen Ionenkanäle in der Netzhaut Berechnungen zu untersuchen. Die gleichen Informationen können nicht durch extrazellulären spike-Aufnahmen oder Aufnahmen mit scharfen Elektroden erzielt werden.
- Diese Technik kann auf andere Tiermodelle angewandt werden
Nachteile:
- Prozesse könnten off in den Prozess des Schneidens schneiden zu lassen. Daher könnte Studien, die auf die räumliche rezeptiven Feld konzentrieren schwierig sein.
- Wie in den meisten retinalen in vitro Vorbereitungen für Elektrophysiologie ist das Pigmentepithel entfernt, was zu der Photorezeptoren Bleiche führen. Studien, dass die Stimulation benötigen mit hohen Lichtintensitäten oder müssen die Netzhaut unter vielen Anpassung Staaten Studie könnte in Schwierigkeiten mit dieser Technik laufen.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
