Summary
Bu video su kaplan semender retina dilim tam hücreli gerilim kelepçe kayıtları süreci gösterir. Biz yanı sıra retinanın görsel uyarılma sırasında yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl dilim hazırlık göstermektedir.
Abstract
Biz sinaptik devre retina temelini görsel bilgi işlem çalışma tüm hücre yama klemp tekniği kullanır. Bu video, retina dilim hazırlanmasında tek tek hücrelerin ışık uyarılmış akımları tüm hücre kayıtları gerçekleştirme süreci boyunca size rehberlik edecektir. Biz bir hayvan modeli olarak su kaplan semender kullanın. Biz göz diseksiyonu anlatarak başlamak ve elektrofizyolojik kayıtlar için dilimleri nasıl monte edilir göstermek. Dilim kayıt odasına yerleştirildikten sonra, biz, tüm hücre gerilimi kelepçe kayıtları nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir. Daha sonra ışık uyarılmış akım tepkiler üzerine görsel uyaranlara dilim fotoreseptörlerin proje. 8-kanal perfüzyon sistemi bizi hızla farklı ajanlar arasında geçiş yapmanıza olanak tanır bu sayede kayıt sırasında, farmakolojik ajanların dilim serpmek. Retina dilim hazırlık yaygın bir bütün montaj hazırlanmasında erişilebilir değil amacrine veya bipolar hücreleri, özellikle çalışma retina yama kelepçe kayıtları için kullanılır.
Protocol
Çözümler
- Ganglion hücreleri için intrasellüler çözüm (mM): 100 K-glukonat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 Hepes, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mcM Sulforhodamine B (boyama), pH = 7.4 için ayarlanabilir KOH
- Bipolar hücreler (mM) Hücre içi çözüm: 90 K-glukonat, 8 KCl 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 Hepes, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mcM Sulforhodamine B (boyama), pH = 7.4 ayarlanabilir KOH
- Ekstrasellüler Ringer solüsyonu (mM): NaCl 112, 5 Glikoz, 5 Hepes, NaOH ile pH = 7.75 ayarlanabilir 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2,. Çözümün oksijenasyon gerekli değildir.
Kayıt odaları hazırlayın
Bizim kayıt odası, başka bir yapıştırıcı kesip küçük silikon blokları doku dilimleri için istikrarı sağlamak için yerleştirilir iyi hangi bir yapıştırıcı ile bir mikroskop lamı oluşur.
Retina dilimleri Hazırlanması
Fotoreseptörlerin beyazlatma önlemek için, diseksiyon, kızılötesi veya loş kırmızı ışık yürütülmektedir. Bir çubuk yolu yanıtları kayıt ilgilenen ise, sadece kızılötesi ışık (IR diseksiyon mikroskobu ve hiçbir oda ışığı Ek IR gözlük mikroskop altında yapmadı işlemleri için kullanılmalıdır) kullanılmalıdır. Ağırlıklı olarak, koni ışık yanıtları, loş kırmızı oda ışık veya kırmızı bir flaş ışığı kayıt ilgilenen kullanılabilir. Ancak, mikroskop, hala IR Okülerin olmalıdır.
Fotoreseptör giriş deneme için alakasız ise, prosedürleri düzenli bir mikroskop kullanılarak, normal oda ışığında yürütülen olabilir.
- , Iyi bir yapıştırıcı, silikon ile iki mikroskop slaytlar hazırlayın: (filtre iterek her slaytta silikon gres iki paralel grup (yaklaşık 0,5 cm arayla) ve dikdörtgen bir parça filtre kağıdı slayt bir tarafta yer, hem de yağ bantları geçiş iyi slayt bağlı olduğu, böylece bir jilet parçası olan kağıt)
- Hayvan sonra dekapite ve çift pithed, 30 dakika boyunca bir buz banyosunda yerleştirilir: kurulan protokolleri göre bir semender Kurban.
- Semender kafa göz çıkarın ve bir parça kağıt mendil diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk Ringer solüsyonu ile ıslatılmış
- Gözün bağ dokusu çıkarın
- Korneada küçük bir kesi yapmak için jilet kullanın.
- Boyunca makasla göz ekini çıkarırken forseps ile kornea kesmek tutun
- Forseps ile lensi çıkarın
- Forseps ile iris tutun ve iris kaldırmak için ora serrata boyunca kesim
- Göz yuvası iki dikdörtgen parçalar halinde Kes
- (Çok dikkatli bir şekilde aşağı iterken parça düzleştirmek için emin olun) adet Pick up ve filtre kağıdı IT sklera yan yerde
- Yavaşça filtresi kağıt bağlı olması gereken, retina kapalı sklerasına kaldırın
- Hızla de buz gibi soğuk Ringer solüsyonu
- Ikinci parça için de tekrarlayın.
- 200-300μm geniş bir dilim kesmek için özel yapılmış dilimleyici yerleştirilen bir jilet kullanın.
- Forseps bir çift kullanın, filtre kağıdı yan dilim almak için, retina katmanları görünür hale gelir, böylece onları ters çevirin ve vakum gres bantlar yer
- Hasarsız görünüyor ve retina katmanları (büyütme yeterince yüksek değildir katmanları tek bazı katmanlama tanıyabilir ancak dilim genellikle yeterince iyi, bazen diseksiyon mikroskop altında görmek zor gösteren yatay bantlar gösteren bir dilim seçin. dik mikroskop altında incelendi) sonra dilim kullanmak konusunda nihai karar, ancak yapılır. Iki slaytlar arasındaki Zil köprü inşa kayıt odası slayt Move it
- Slice (ganglion hücreleri ve fotoreseptör aynı zamanda odak noktası olmalıdır) eğik olmayacak şekilde filtre kağıdı, kauçuk bloklar kayıt odasında karşı itilir emin olun.
Kayıt teçhizat doku yerleştirmek
- Kayıt slayt mikroskop altında yerleştirilir ve gravite perfüzyon syste yoluyla Ringer çözümleri ile perfüze
- Hazırlık 10x ve 40x suya daldırma hedefi ile dik bir mikroskop ile görüntülenmiştir.
- Yine, biz sadece fotoreseptörlerin beyazlatma önlemek için kızılötesi ışık kullanır. IR kamera, mikroskop yan bağlantı noktası, bir TV ekranında bağlı eklenir.
Görsel Uyarım
Görsel uyaranlara Psychtoolbox kullanarak Matlab programlanmış ve mikroskop mikroskop görüntüsü enjektör (MBF biyobilim) kullanarak üst bağlantı noktası üzerinden retina yansıtılıyor. A Bit + + Dijital Video İşlemci (Cambridge Araştırma Sistemleri) 14bit parlaklık ölçeği elde Senkron için kullanılır.veri toplama ile uyaran sunum onize. Bu video kullanılan görsel uyaranlar, iki saniye boyunca sabit bir üniforma arka plan (sunuldu% 100 kontrast, parlak veya koyu bar (width = 460μm). Parlaklık = 8 * 10 4 fotonlar / mm / s, boyutu: 1.84 x 1.38mm).
Elektrofizyoloji
- Mikropipet çektirmenin: Patch elektrotlar borosilikat cam (1.5mm ID 84mm. OD) çekti. Ganglion hücreleri için, dirençler 2 ve 4 Mohms arasında. Bipolar hücreler için, 4 ve 8 Mohms arasında yüksek dirençleri kullanılır.
- Gerilim Kelepçe kayıtları Multiclamp 700A (Moleküler Cihazlar), amplifikatör ve Labview programlanmış laboratuar dahili yazılımı kullanılarak yapılmaktadır.
- İlaçlar bir 8-kanal perfüzyon sistemi yoluyla perfüze. Microperfusion elektrot dilim (kapalı perfüzyon açmak ve doku gözle görülür bir şekilde hareket etmelidir, ancak bir ihtiyacı basıncı dilim filtre kağıdı kopuk haline gelebilir, böylece çok güçlü olmadığını dikkatli olmak) yakın yerleştirilir. Microperfusion deneyler sırasında sürekli kayıt perfüzyon açılması ve kapatılması rahatsız etmediğini (Uyuşturucu ihtiyaç vardır perfüze kontrol çözümü) açık olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Faydaları:
- Tüm hücre türlerine erişilebilir
- Kolay hücre tiplerinin tanımlanması, özellikle floresan boya elektrot çözüm ise
- Farmakolojik ajanların hedef hücrelere kolaylıkla ulaşabilirsiniz
- Yama klemp tekniği, retina hesaplamaları farklı iyon kanalları rolünü araştırmak için izin verir. Aynı bilgiler, keskin elektrotlar extracelluar başak kayıtları veya kayıtlar yoluyla elde edilemez.
- Bu teknik diğer hayvan modelleri uygulanabilir
Dezavantajları:
- Süreçler dilimleme süreci kesilir. Bu nedenle, mekansal açık alan odaklanma çalışmaları zor olabilir.
- Elektrofizyoloji için kullanılan in vitro hazırlıklarında en retina pigment epitel fotoreseptörlerin beyazlatma yol açabilir kaldırılır. Yüksek ışık şiddetleri ile stimülasyon gerektiren veya birçok adaptasyon durumları altında retina çalışma gerekir Çalışmalar bu tekniği ile zorluklar içine çalışabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
