In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Summary

In diesem Video zeigen wir, wie man menschliche embryonale Stammzellen (hES) mit Manganchlorid (MnCl Label

Abstract

Humane embryonale Stammzellen (hES) haben die Möglichkeit, den verletzten Herzmuskel wieder unter Beweis gestellt. Magnetic Resonance Imaging (MRI) hat als eines der vorherrschenden bildgebenden Verfahren entstanden, um die Wiederherstellung der verletzten Herzmuskel zu beurteilen. Darüber hinaus haben ex-vivo-Markierung Mittel, wie Eisenoxid-Nanopartikel, eingesetzt worden, um zu verfolgen und lokalisieren die transplantierten Stammzellen. Allerdings funktioniert diese Methode nicht überwachen eine grundlegende zellbiologische Eigentums in Bezug auf die Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen. Es ist bekannt, dass Manganchlorid (MnCl ₂₎ die Zellen über spannungsgesteuerte Calcium (Ca ^{2 +)-Kanäle,} wenn die Zellen biologisch aktiv sind betritt, und reichert sich intrazellulär zu T ¹ Verkürzung Effekt zu erzeugen. Daher empfehlen wir, dass Mangan-geführten MRT kann hilfreich sein, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transplantation von embryonalen Stammzellen in den Herzmuskel zu überwachen.

In diesem Video zeigen wir, wie man hESC mit MnCl ₂ und wie diese Zellen deutlich mit MRI in vitro beobachtet werden label. Zur gleichen Zeit, die biologische Aktivität von Ca ^{2 +-Kanäle} moduliert werden unter Verwendung von sowohl Ca ^{2 +-Kanal-Agonist} und Antagonist zur gleichzeitigen Signalwechsel zu bewerten.

Protocol

Mangan Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen

1. Trypsinize der humanen embryonalen stammt, die in Feeder-freien Bedingungen für 5 Minuten wurden kultiviert. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von Nährmedien.
2. Spin down die Zellen durch Zentrifugation bei 800 rpm für 5 Minuten bei 20 ° Celsius. Nach Resuspendieren des Zellpellets, zählen die Anzahl der Zellen durch Trypanblau-Färbung. Basierend auf der Zellzahl erhalten, teilen sich die Zellen in vier Aliquots von 3 Millionen Zellen in konische Rohre. Pellet die Zellen wieder abzentrifugiert.
3. Kurz vor dem Start der Mangan-Kennzeichnung, lösen sich frische Manganchlorid mit 0,9% Natriumchlorid-Lösung, um eine 0,1 Millimeter Manganchloridlösung machen.
4. Um Calcium-Kanal-Aktivität zu beobachten, wurden vier Proben hergestellt. Die erste Probe wird unserer Kontrolle, welche Zellen in 0,9% Natriumchlorid allein inkubiert enthält. Die zweite Probe enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ inkubiert. Beispiel 3 und 4 enthalten Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ entweder mit 5 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Agonisten} inkubiert (S )-(-)- Bay K8644 oder 250 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Antagonisten,} Verapamil. Inkubieren Sie die vier Proben bei 37 ° Celsius mit 5% CO ₂ für 30 Minuten.
5. Nach 30 Minuten Spin-Down die Zellen bei 800 rpm für 5 Minuten bei 20 ° Celsius. Dann saugen Sie den Überstand und waschen Sie die markierten Zellen zweimal mit PBS. Nach dem Waschen wieder auszusetzen jedes Pellet mit 200 ul PBS und Überführung in PCR-Röhrchen. Diese Pellets werden in der Regel weiß.

Eisen Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen

1. Mix klinisch-grade Protaminsulfat mit destilliertem Wasser zu einer 1 mg / ml Stammlösung erhalten.
2. In ein Röhrchen mit menschlichen embryonalen Stammzellen Kulturmedien, fügen ferumoxides bei 100 ug / ml durch Zugabe von 12 ug / ml Protaminsulfat gefolgt. Mischen Sie die Lösung kräftig für fünf Minuten.
3. Add gemischte Lösung, die gleiche Menge des Zellkulturmedien zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml ferumoxides und 6 pg / mL der Protaminsulfat zu beschriften Zellen zu erreichen. Inkubieren Zellen in dieser Lösung für 12 Stunden.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, mit dem letzten Waschschritt mit 10U/ml Heparin an die extrazelluläre ferumoxides-Protaminsulfat komplexen aufzulösen. Nach dem Waschen trypsinize Zellen zu einer einzigen Zelle Suspension zu erhalten.
5. Zählen Sie die Zellen und Aliquot in die erforderliche Anzahl von Proben. Nach dem Waschen wieder auszusetzen jedes Pellet mit 200 ul PBS und Überführung in PCR-Röhrchen. Diese Pellets sollten dunkel orange-braun in Farbe sein.

Performing Cellular Magnetic Resonance Imaging

1. Machen Sie ein Phantom, um die Röhrchen mit den Zellpellets zu stabilisieren und auch Artefakte aus der Umgebungsluft während des Scanvorgangs zu vermeiden. Dazu mischen 0,8% Agar und 1% Kupfersulfat in destilliertem Wasser und bringen es zum Kochen von microwaving für 5-7 Minuten. Coole diese Mischung für mindestens 1 Stunde vor der Abtastung zu einem Gel zu erreichen.
2. Das Röhrchen mit dem markierten Zellpellets werden in dem Phantom für das Scannen platziert. In-vitro-Zell-MRT ist bei Signa HDx 3T-MRT (GE Medical Systems) mit klinischen Kniespule durchgeführt.
3. Scan der Mangan-markierten Zellen für jede der drei Proben mit einem Spin-Echo-Sequenz: TR; Wiederholung Zeit = 800 ms. TE; Echo Zeit = Minimum, FOV; Sichtfeld = 12 x 12 cm; matrix = 256x256, NEX 1.
4. Scan der Eisen-markierten Zellen mit Hilfe eines Gradienten-Echo-Sequenz. Wir verwenden die folgenden Einstellungsmöglichkeiten für den Imaging: TR = 100 ms; TE = 10 ms, FA; Flipwinkel = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; Matrix = 256 x 256, NEX 1.

Die Analyse der MRT-Ergebnisse

1. Analysieren Sie Bilder von MRT-Untersuchung von 4 verschiedenen Proben von Mangan-markierten Zellen:
   • Probe Nr. 1 ist unsere steuern, welche Zellen in 0,9% Natriumchlorid allein inkubiert enthält.
   • Probe Nr. 2 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ inkubiert.
   • Probe Nr. 3 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ mit 5 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Agonisten} (S )-(-)- Bay K8644 inkubiert.
   • Probe Nr. 4 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ mit 250 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Antagonisten,} Verapamil inkubiert.
2. Wie vorhergesagt, sind die Unterschiede in Signalintensitäten aus Mangan markierten Zellen sichtbar. Im Vergleich zu den Zellen rein mit Mangan gekennzeichnet, die Signalintensität deutlich erhöht in Anwesenheit des Calcium-Kanal-Agonist und nimmt in der Anwesenheit von Calcium-Kanal-Antagonisten. Der Bereich, in dem Signalintensität für Mangan markierten Zellen erhöht hat, sind mit Image J (NIH, Bethesda, MD, USA) gemessen. Die gleiche Software ist für die Analyse im Bereich der dunklen off-resonance-Signal aus der Eisen-markierten Zellen verwendet. Die Größe der dunklen Signal aus der Eisen-markierten Zellen hängt von der Anzahl der Zellen oder die Anzahl der Eisenteilchen durch Zellen enthalten. In diesem Fall, Eine Million Zellen zeigt eine kleinere Fläche des dunklen Signal im Vergleich zum Signal von den drei Millionen Zellen.

Discussion

Diese Ergebnisse zeigen, dass Mangan nicht über den spannungsabhängigen Calcium-Kanal-und Mangan können als Kontrastmittel eingesetzt werden, die auch zeigen können, die die Lebensfähigkeit der Zellen geben. Daher empfehlen wir, dass Mangan-geführten MRT kann hilfreich sein, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen in den Herzmuskel zu überwachen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190