Summary
Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.
Abstract
Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.
Protocol
HESCs división de Matrigel de Matrigel
Por lo general, una confluencia de 6 pocillos de hESCs en Matrigel se puede dividir 1:03-1:05 a otra placa de Matrigel, con los pozos cada vez más confluentes 4-5 días después de partir.
- CM y las placas de Matrigel se preparan como se describe arriba antes de separarse.
- En el día de la división, lave cada pocillo para dividir con PBS 1X, pH 7,4, agregar 1 ml de 1mg/ml Dispasa (la solución diluida de valores 5mg/ml con DMEM/F12 los medios de comunicación) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
- Lavar cada pocillo tres veces con PBS 1X, pH 7,4, agregar 1 ml de ES medios de comunicación sin bFGF, use una espátula para raspar las colonias de células de la parte inferior del pozo, recoger las hESCs en suspensión en un tubo de 50 ml de halcón, y el precipitado por centrifugación a 200 g por 5 min a temperatura ambiente.
- Para volver a la placa de hESCs en las placas de Matrigel, primero se deben lavar las placas con Matrigel DMEM/F12 y añadir 2,5 ml de la CM complementado con 10ng/ml bFGF por pozo. Resuspender las células madre de pellets en un volumen adecuado de CM complementado con 10ng/ml bFGF, pipeta de la suspensión celular arriba y hacia abajo tres veces. (NOTA: Cuando hESCs para la división proviene de las placas Matrigel, los grupos son muy fáciles de romper, por tres rondas de pipeteado es suficiente y más de pipeteo puede alterar demasiado las colonias y hacer que las células individuales.) Alícuota de 0,5 ml de suspensión de células madre por grupos pocillo de la placa de 6 pocillos Matrigel para lograr 3 ml por pocillo en un volumen final. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C.
Detección de marcadores de pluripotencia por microscopía de inmunofluorescencia
Microscopio de inmunofluorescencia se utiliza para examinar la expresión de marcadores de células madre pluripotencia Oct-4 y 4-SSEA durante el cultivo.
- Aspirar los medios de comunicación de un bien y lavar con PBS 1X, pH 7,4. Añadir 2 ml de 3,7% de formaldehído al pozo para fijar durante 10 min.
- Enjuague con 1XPBS, pH 7,4, agregar 2 ml de metanol para el bienestar y el lugar de -20 º C durante 2 min.
- Enjuague con 1XPBS, pH 7,4, y el bloque con 1 ml de 0,2% serume albúmina bovina (BSA) durante 5 min.
- Añadir 1 ml de anticuerpos Oct-4 o anti-h/mSSEA-4 (dilución 1:200 en 0,2% de BSA) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche. (NOTA: para SSEA-4 tinción, vaya directamente al paso 6)
- Enjuáguese la boca tres veces con 1XPBS, pH 7,4, agregar FITC-conjugado de IgG de conejo (dilución 1:500 en 0,2% de BSA) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
- Enjuague tres veces con 1XPBS, pH 7,4, y poner una gota de solución de montaje (puede contener DAPI nuclear si la visualización se desea) en el centro del pozo. Poner el cubreobjetos en la parte superior de las células, sello con el esmalte de uñas, y evaluar por microscopía de inmunofluorescencia.
Recibos de embriones humanos con células madre
ES medios de comunicación (medios de comunicación de células madre embrionarias):
DMEM/F12 - 400ml
Octavos de final de suero Replacer - 100 ml
No aminoácidos esenciales - 5 ml
200 mM Glutamax / BME de soluciones - 5 ml
Penicilina / estreptomicina - 5 ml
Mezclar bien y guardar final de Medios de cultivo células madre en botellas de 500 ml a 4 ° C. Bueno para un máximo de dos semanas.
MEF cultura de los medios:
DMEM - 1000 ml
FBS - 100 ml
No aminoácidos esenciales - 10 ml
Glutamina - 10ml
Penicilina / estreptomicina - 10ml
Mezclar bien y guardar final de Medios de Cultivo MEF a 4 ° C.
200 mM Glutamax / BME de solución:
Glutamax - 100 ml
β-mercaptoetanol (solución de archivo de 14,3 millones) - 140 μ1
Mezclar dos soluciones bien y luego las alícuotas de 10 ml. Mantenga alícuotas a -20 ° C.
bFGF solución (concentración final de stock: 10 microgramos / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mg
0,1% de BSA en 1XPBS, pH 7,4 - 5 ml
Disolver 50 microgramos bFGF en 5 ml de BSA al 0,1% para un 10 ug / ml de caldo. Alícuota en porciones de 500 microlitros. Almacenar a -80 ° C.
Colagenasa IV de la solución (1mg/ml):
Colagenasa IV - 50 mg
DMEM/F12 los medios de comunicación - 50ml
Agregue el polvo de la colagenasa IV a un tubo de 50 ml de halcón. En la capilla, la mezcla en 50 ml de agua estéril DMEM/F12 los medios de comunicación. Vortex la solución de <1 min. para asegurarse de que el polvo se disuelva. En la capilla, pasan por un filtro de 0,22 micras en un nuevo tubo de 50 ml estéril halcón. Esta solución es buena para un máximo de 2 semanas si se almacena a 4 ° C.
Dispasa solución (1mg/ml):
Dispasa 5mg/ml - 2 ml
DMEM/F12 los medios de comunicación - 8ml
Alícuota comerciales 5mg/ml solución Dispasa y almacenar a -20 ° C. Diluir dispasa a 1mg/ml utilizando DMEM/F12. Esta solución puede conservarse durante una semana a 4 ° C.
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Discussion
Esta serie de tres videos muestra cómo crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en fibroblastos de embriones de ratón (MEF), las células de alimentación (video 1), cómo paso a Matrigel libre de células de alimentación placas (video 2), y cómo mantener la hESCs por pases en el alimentador de Matrigel de células en condiciones libres (video 3). Numerosos estudios previos mostraron que el mantenimiento de hESCs viable, no diferenciado requiere la cultura en las células inactivadas MEF alimentador. Sin embargo, para muchos experimentos, una población pura de hESCs libre de contaminación de alimentación celular es necesario. Para lograr este objetivo, hemos demostrado cómo hESCs paso de placas de alimentación MEF alimentador de células libres de placas de Matrigel y cómo mantener y continuamente las colonias de células madre a paso en el alimentador de condiciones libres de células. Siguiendo este protocolo, una pequeña cantidad de contaminación MEF células de alimentación aún podría existir en un pasaje en una placa de Matrigel, pero este contaminante es usualmente fácil de visualizar. En el paso Matrigel dos y más allá, no hay contaminación MEF se encuentra normalmente, dejando una población pura de hESCs para los experimentos. La tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo o microscopía para los marcadores de células madre pluripotencia, tales como Oct-4 y SSEA-4, son necesarios para confirmar el mantenimiento de hESCs en estado indiferenciado en cultivo.
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Acknowledgments
Estudios en humanos con células madre embrionarias en el laboratorio Teitell el apoyo de un Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), las semillas de subvención RS1-00313. Agradecemos a los miembros del Centro de Medicina Regenerativa de amplias e Investigación de Células Madre de la UCLA, en especial el Dr. Amander Clark, el doctor Jerome Zack, y los miembros del Fondo para el UCLA amplio núcleo de célula madre Instituto por el apoyo de nuestros estudios.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
