Summary
इस वीडियो को दर्शाता है कैसे फीडर सेल मुक्त परिस्थितियों में और कैसे लगातार फीडर में बीतने hESCs सेल मुक्त शर्तों मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) के विकास को बनाए रखने के लिए. HESC की पुष्टि pluripotency immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल मुक्त शर्तों फीडर में हो यह भी दिखा दिया है. 3 के 3 भाग.
Abstract
इस वीडियो को दर्शाता है कैसे फीडर सेल मुक्त परिस्थितियों में और कैसे लगातार फीडर में बीतने hESCs सेल मुक्त शर्तों मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) के विकास को बनाए रखने के लिए. HESC की पुष्टि pluripotency immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल मुक्त शर्तों फीडर में हो यह भी दिखा दिया है.
Protocol
Matrigel से Matrigel बंटवारे hESCs
आम तौर पर Matrigel पर hESCs मिला हुआ 6-अच्छी तरह से थाली अन्य Matrigel थाली में 1:5 करने के लिए 1:3 विभाजित कर सकते हैं कुओं मिला हुआ 4-5 दिन के बंटवारे के बाद फिर से बनने के साथ.
- मुख्यमंत्री और Matrigel प्लेटें बंटवारे से पहले ऊपर वर्णित के रूप में तैयार कर रहे हैं.
- बंटवारे के दिन पर, बंटवारे के लिए 1 के साथ एक अच्छी तरह × धोने Pbs, pH7.4, एक अच्छी तरह से 1mg/ml Dispase (पतला DMEM/F12 मीडिया के साथ 5mg/ml शेयर समाधान) के 1ml जोड़ने के लिए, और 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए.
- 1 प्रत्येक के साथ अच्छी तरह तीन बार धो × pH7.4 Pbs, bFGF बिना ES मीडिया के 1ml जोड़ने के लिए, एक सेल खुरचनी का उपयोग अच्छी तरह से नीचे बंद कालोनियों परिमार्जन, 50ml बाज़ ट्यूब में निलंबित कर दिया hESCs इकट्ठा करने के लिए, और centrifugation द्वारा गोली कमरे के तापमान पर 200g पर 5 मिनट के लिए.
- फिर प्लेट Matrigel प्लेटों पर hESCs DMEM/F12 के साथ पहली बार Matrigel प्लेटें धोने और मुख्यमंत्री के 2.5ml अच्छी तरह से प्रति 10ng/ml bFGF के साथ पूरक जोड़ें. 10ng/ml bFGF, विंदुक सेल निलंबन ऊपर और नीचे तीन बार के साथ पूरक मुख्यमंत्री का एक उचित मात्रा में गोली hESC Resuspend. (नोट:: जब बंटवारे के लिए hESCs Matrigel प्लेटों से आते हैं, clumps को तोड़ने बहुत आसान कर रहे हैं, इसलिए pipetting के तीन दौर के लिए पर्याप्त है और अधिक कालोनियों से अधिक बाधित हो सकता है और एकल कक्षों pipetting) विभाज्य hESC clumps प्रति निलंबन की 0.5 मिलीलीटर अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह Matrigel थाली के 3ml प्राप्त करने के लिए एक अंतिम मात्रा के रूप में प्रति अच्छी तरह से. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.
Pluripotency मार्करों के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाने
Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी hESC संवर्धन के दौरान pluripotency Oct-4 और SSEA-4 मार्करों की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक अच्छी तरह से मीडिया Aspirate और 1 से धो × Pbs, 7.4 पीएच. अच्छी तरह से 3.7% formaldehyde के 2ml जोड़ें 10 मिनट के लिए तय.
- 1xPBS, पीएच 7.4 से कुल्ला, अच्छी तरह से और -20 में जगह ° सी 2 मिनट के लिए 2ml मेथनॉल जोड़ने.
- 1ml 0.2% 5 मिनट के लिए, गोजातीय albumin serume (BSA) के साथ 1xPBS, 7.4 पीएच, और ब्लॉक के साथ कुल्ला.
- Oct-4 या anti-h/mSSEA-4 एंटीबॉडी (0.2% BSA में 1:200 कमजोर पड़ने) की 1ml जोड़ें, और 1 घंटे के लिए या कमरे के तापमान 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं. (नोट: SSEA चार धुंधला के लिए सीधे जाने के लिए चरण 6)
- 1xPBS, 7.4 पीएच के साथ तीन बार कुल्ला, FITC संयुग्मित खरगोश (0.2% BSA में कमजोर पड़ने 1:500) आईजीजी है, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं जोड़ने.
- 1xPBS, 7.4 पीएच के साथ 3 बार कुल्ला, और बढ़ते समाधान के एक बूंद (DAPI होते यदि परमाणु दृश्य वांछित है) अच्छी तरह से केंद्र में डाल दिया. कक्षों की चोटी पर रखो coverslip, नेल पॉलिश के साथ सील, और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन.
मानव भ्रूण स्टेम सेल प्राप्तियों
ES मीडिया (भ्रूणीय स्टेम सेल मीडिया):
DMEM/F12 - 400ml
नॉकआउट सीरम replacer - 100ml
गैर आवश्यक अमीनो एसिड - 5ml
200mm / GlutaMax BME समाधान - 5ml
पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन - 5ml
अच्छी तरह मिक्स और 4 में 500ml बोतलों में अंतिम hESC संस्कृति मीडिया की दुकान डिग्री सेल्सियस दो सप्ताह की एक अधिकतम के लिए अच्छा है.
MEF संस्कृति मीडिया:
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
गैर आवश्यक अमीनो एसिड - 10ml
Glutamine - 10ml
Penicllin / स्ट्रेप्टोमाइसिन - 10ml
अच्छी तरह मिक्स और 4 पर अंतिम MEF संस्कृति मीडिया की दुकान डिग्री सेल्सियस
200mm समाधान / Glutamax BME:
Glutamax - 100ml
(14.3M पर स्टॉक समाधान) β-mercaptoethanol - 140 μ1
दो अच्छी तरह से और फिर समाधान विभाज्य 10ml भाग मिक्स. -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots रखें
bFGF समाधान (शेयर के अंतिम एकाग्रता: 10 micrograms / एमएल):
(FGF2) bFGF - 50 μg
0.1% BSA 1xPBS में, 7.4 पीएच - 5ml
50 माइक्रोग्राम 5ml 0.1% BSA में bFGF भंग करने के लिए एक 10 शेयर / μg मिलीलीटर. 500 μl भागों में विभाज्य. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस
Collagenase चतुर्थ समाधान (1mg/ml):
Collagenase चतुर्थ - 50mg
DMEM/F12 मीडिया - 50ml
एक 50ml बाज़ ट्यूब collagenase चतुर्थ पाउडर जोड़ें. हुड में, 50ml बाँझ DMEM/F12 मीडिया के मिश्रण. भंवर <1 मिनट के लिए समाधान. सुनिश्चित करें पाउडर भंग है. हुड में एक 0.22 सुक्ष्ममापी एक नया बाँझ 50ml बाज़ ट्यूब में फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. यह 2 सप्ताह की एक अधिकतम 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस के लिए अच्छा समाधान है
Dispase समाधान (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 मीडिया - 8ml
विभाज्य वाणिज्यिक Dispase 5mg/ml और -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान Dispase पतला DMEM/F12 का उपयोग 1mg/ml. यह समाधान 4 में 1 सप्ताह के लिए रखा जा सकता डिग्री सेल्सियस
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Discussion
3 वीडियो की इस श्रृंखला को दर्शाता है कैसे माउस भ्रूण fibroblast पर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) विकसित करने के लिए फीडर (MEF) (1 वीडियो) कोशिकाओं, उन्हें बीतने फीडर सेल मुक्त प्लेटें (2 वीडियो) Matrigel कैसे, और कैसे बनाए रखने के लिए Matrigel फीडर सेल मुक्त स्थितियों (3 वीडियो) में passaging द्वारा hESCs. कई पूर्व अध्ययनों से पता चला कि व्यवहार्य, undifferentiated hESCs के रखरखाव निष्क्रिय MEF फीडर कोशिकाओं पर संस्कृति की आवश्यकता है. हालांकि, कई प्रयोगों के लिए, फीडर सेल संदूषण के मुक्त hESCs के एक शुद्ध आबादी की आवश्यकता है. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम बीतने hESCs MEF फीडर प्लेटों से कैसे फीडर सेल मुक्त Matrigel प्लेटें और बनाए रखने के लिए कैसे और फीडर में लगातार बीतने hESC कालोनियों सेल मुक्त स्थितियों का प्रदर्शन किया है. इस प्रोटोकॉल का अनुसरण करके, MEF फीडर सेल संदूषण की एक छोटी राशि अभी भी एक Matrigel थाली पर एक मार्ग पर मौजूद सकता है, लेकिन इस contaminant आमतौर पर कल्पना करना आसान है. Matrigel बीतने के दो और परे, नहीं MEF संदूषण आमतौर पर पाया जाता है प्रयोगों के लिए hESCs के एक शुद्ध आबादी छोड़ने. Immunofluorescence और hESC Oct-4 और SSEA-4, जैसे pluripotency मार्करों, के लिए माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry धुंधला संस्कृति दौरान एक undifferentiated राज्य में hESCs के रखरखाव की पुष्टि करने की जरूरत हैं.
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Acknowledgments
Teitell प्रयोगशाला में मानव भ्रूण स्टेम सेल के अध्ययन से पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) बीज अनुदान RS1 ००,३१३ द्वारा समर्थित हैं. हम पुनर्योजी चिकित्सा और UCLA, विशेष रूप से डॉ. Amander क्लार्क, डॉ. जेरोम जैक, और UCLA ब्रॉड संस्थान हमारे अध्ययन के उनके समर्थन के लिए स्टेम सेल कोर सुविधा के सदस्यों में स्टेम सेल रिसर्च के ब्रॉड केंद्र के सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
