Summary
Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.
Abstract
Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.
Protocol
Splitting hESCs von Matrigel auf Matrigel
Normalerweise wird eine konfluente 6-Well-Platte von hESCs auf Matrigel können split von 1.03 Uhr bis 01.05 Uhr zu einem anderen Matrigel Platte werden, mit dem Brunnen zu konfluenten wieder 4-5 Tage nach der Trennung.
- CM und Matrigel Platten werden wie oben beschrieben vor der Spaltung.
- Am Tag der Aufspaltung, waschen jede Vertiefung für die Spaltung mit 1 x PBS, pH 7,4, 1ml von 1mg/ml Dispase (verdünnte 5mg/ml Stammlösung mit DMEM/F12 Medien) in jede Vertiefung, und bei 37 ° C für 3 min.
- Wash jedes Well dreimal mit 1 × PBS, pH 7,4, 1ml von ES Medien ohne bFGF, verwenden Sie einen Zellschaber Kolonien aus dem Boden des Brunnens zu kratzen, sammeln die suspendierten hESCs in einem 50ml Falcon-Röhrchen und Pellet durch Zentrifugation bei 200g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Zum erneuten Platte der hESCs auf Matrigel Platten ersten Waschen die Matrigel-Platten mit DMEM/F12 und fügen 2,5 ml CM mit 10ng/ml bFGF pro Vertiefung ergänzt. Resuspendieren hESC Pellet in einem geeigneten Volumen von CM mit 10ng/ml bFGF, Pipette die Zellsuspension nach oben und unten drei Mal ergänzt. (Hinweis: Wenn hESCs zur Aufspaltung von Matrigel Platten kommen, sind die Klumpen sehr leicht zu brechen, deshalb drei Runden Pipettieren ist genug und mehr Pipettieren kann over-stören den Kolonien und Einzel-Zellen.) Aliquot von 0,5 ml hESC Klumpen Suspension pro auch der 6-well Matrigel Platte 3ml pro Vertiefung zu erreichen, wie ein Endvolumen. Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator.
Nachweis der Pluripotenz Marker durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie
Immunfluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um die Expression von humanen embryonalen Stammzellen Pluripotenz Marker Oct-4 und SSEA-4 während der Kultivierung zu untersuchen.
- Saugen Sie Medien aus einer gut und waschen mit 1 x PBS, pH 7,4. Add 2 ml 3,7% Formaldehyd zum Brunnen, um für 10 Minuten zu beheben.
- Spülen Sie mit 1xPBS, pH 7,4, fügen 2ml Methanol zum Brunnen und bei -20 ° C für 2 min.
- Spülen Sie mit 1xPBS, pH 7,4, und Block mit 1 ml 0,2% Rinder serume Albumin (BSA) für 5 min.
- 1ml von Oct-4 oder anti-h/mSSEA-4 Antikörper (1:200 Verdünnung in 0,2% BSA) und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht. (Hinweis: für SSEA-4-Färbung, gehen Sie direkt zu Schritt 6)
- Spülen Sie dreimal mit 1xPBS, pH 7,4, fügen FITC-konjugierten Kaninchen-IgG (1:500 Verdünnung in 0,2% BSA) und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- Spülen Sie 3-mal mit 1xPBS, pH 7,4, und geben Sie einen Tropfen der Montage-Lösung (kann DAPI enthalten, wenn nukleare Visualisierung gewünscht wird) in der Mitte des Brunnens. Put Deckglas oben auf die Zellen, das Siegel mit Nagellack und evaluieren durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie.
Menschliche embryonale Stammzellen Einnahmen
ES Medien (embryonale Stammzell-Medien):
DMEM/F12 - 400ml
Knockout Serum Replacer - 100ml
Non-Essential Amino Acids - 5ml
200 mM Glutamax / BME-Lösung - 5ml
Penicillin / Streptomycin - 5ml
Gut durchmischen und endgültige hESC Nährmedien in 500ml-Flaschen bei 4 ° C. Gut für maximal zwei Wochen.
MEF Culture Media:
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Non-Essential Amino Acids - 10ml
Glutamin - 10ml
Penicllin / Streptomycin - 10ml
Gut durchmischen und endgültige MEF Nährmedien bei 4 ° C.
200 mM Glutamax / BME-Lösung:
Glutamax - 100ml
β-Mercaptoethanol (Stock-Lösung bei 14,3 Mio.) - 140 μ1
Mix beiden Lösungen gut und dann aliquoten 10ml Portionen. Keep Aliquots bei -20 ° C.
bFGF-Lösung (Endkonzentration Lager: 10 Mikrogramm / ml):
bFGF (FGF2) - 50 ug
0,1% BSA in 1xPBS, pH 7,4 - 5ml
Lösen Sie 50 Mikrogramm bFGF in 5ml 0,1% BSA auf eine 10 ug / ml Aktie zu machen. Aliquot in 500 ul Portionen. Lagerung bei -80 ° C.
Collagenase IV-Lösung (1mg/ml):
Collagenase IV - 50mg
DMEM/F12 Media - 50ml
Fügen Sie die Kollagenase IV Pulver zu einer 50ml Falcon-Röhrchen. In der Motorhaube, in 50 ml sterile DMEM/F12 Media-Mix. Vortex die Lösung für <1 min. um sicherzustellen, dass das Pulver aufgelöst ist. In der Motorhaube, durch ein 0,22 um-Filter in eine neue sterile 50ml Falcon-Röhrchen passieren. Diese Lösung ist gut für maximal 2 Wochen bei 4 ° C gelagert
Dispase-Lösung (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 Media - 8ml
Aliquot kommerziellen 5mg/ml Dispase-Lösung und bei -20 ° C. Verdünnen Dispase zu 1mg/ml mit DMEM/F12. Diese Lösung kann für 1 Woche bei 4 ° C aufbewahrt werden
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Discussion
Diese Serie von 3 Videos demonstriert, wie humanen embryonalen Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten wachsen (MEF) Feeder-Zellen (Video 1), wie die Passage ihnen Feeder zellfreien Platten (Video 2) Matrigel, und wie halten hESCs durch Passagieren in Matrigel Feeder zellfreien Bedingungen (Video 3). Zahlreiche frühere Studien zeigten, dass die Wartung von lebensfähigen, undifferenzierte hES erfordert Kultur auf inaktivierten MEF Feeder-Zellen. Doch für viele Experimente, ist eine reine Population von hESCs frei von Feeder-Zellen Kontamination erforderlich. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir gezeigt, wie die Passage hESCs von MEF Feeder Platten Feeder zellfreien Matrigel Platten und wie zu pflegen und kontinuierlich Durchgang hESC Kolonien in Feeder-Zell-freien Bedingungen. Durch Einhalten dieses Protokoll konnte eine kleine Menge von MEF feeder-Zelle Kontamination noch in Durchgang eine auf einem Matrigel Platte vorhanden, aber diese Verunreinigung ist in der Regel einfach zu visualisieren. Am Matrigel Durchgang zwei und darüber hinaus keine MEF Kontamination in der Regel gefunden, so dass eine reine Population von hESCs für Experimente. Immunfluoreszenzfärbung und Mikroskopie oder Durchflusszytometrie für hESC Pluripotenz Marker, wie Oct-4 und SSEA-4, sind nötig, um Wartung von Zellkulturen in einem undifferenzierten Zustand während der Kultur zu bestätigen.
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Acknowledgments
Menschliche embryonale Stammzellen-Studien in der Teitell Labor werden von einem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Saatgut gewähren RS1-00313 unterstützt. Wir danken Mitglieder der Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, vor allem Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, und die Mitglieder des UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility für ihre Unterstützung unserer Studien.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
