Summary
本视频演示，到线虫的性腺创建转基因动物的显微注射技术。
Abstract
转基因线虫可以很容易地创建，通过显微注射DNA质粒的解决方案进入性腺1。质粒DNA的重新排列，形成稳定遗传，但不以同样的效率为 2实际的染色体染色体外concatamers。一个共同感兴趣的基因注入一个明显的表型标记，如ROL - 6或GFP，在解剖显微镜下，允许转基因动物的选择。可能是外源基因表达的细胞定位研究的原始推动者。此外，转基因可以由不同的组织特异性的启动子，以评估在特定的细胞或组织的基因产物的作用。这项技术有效地推动所有组织线虫的生殖细胞或早期胚胎基因表达 3 。转基因动物的创建是广泛使用的实验范式。本视频演示了显微注射过程产生转基因的蠕虫。此外，选择和维护稳定的转基因线虫线描述。
Protocol
表达质粒的构建
需要两个质粒：感兴趣的基因组织特异表达的第二个可选择的改造标记之一。
实验质粒
- 选择一个感兴趣的组织/细胞类型，例如，神经或肌肉特异性启动子表达的启动子。如果是同一组织内的多个基因的表达，在网关系统（Invitrogen）的质粒发起人卡带都可以使用。这种方法允许任何利益recombinational克隆4子下游的基因插入，一般情况下，上游序列2-5 KB足够的正确和准确的表达。
- 感兴趣的基因的cDNA克隆的方法有两种：
- 传统的克隆用限制性内切酶。
- 为Gateway克隆，它是使用包含网关ATT乙 recombinational序列的引物PCR扩增。扩增的cDNA第一重组到捐助载体pDONR201创建入门载体，然后转化到E.大肠杆菌菌株DH5a。入门载体是继成功的重组体的选择和小型预习DNA提取，重组到含有启动子目标的载体，以创建表达质粒。 recombinational克隆的详情，可从Invitrogen公司的网关手册或在考德威尔等5 。
选择标记质粒
转基因标记质粒的例子包括：ROL - 6或使用的体壁肌肉 UNC - 54启动子驱动荧光蛋白的表达。这些标记质粒通常可以从研究界内，根据请求。
微量注射线虫
制备
- 被注入的两个质粒DNA进行隔离。定量，并在50 ng /μL的每一个1:1的比例混合在一起。
- 琼脂垫做准备：
- 直到溶解在水中的2％琼脂糖溶液;加热或微波。
- 在工作台上设置了22 × 50 mm的盖玻片。
- 使用巴斯德吸管，放置在一个玻璃盖一个熔化的琼脂糖下降，立即放置在一个90度的第二个玻璃盖，在下拉到第一。重复其他几个盖玻片。夷为平地的琼脂糖光盘的直径应为15-20毫米之间。
- 后琼脂糖凝固（这个只需要时刻），取出盖玻片，并允许垫完全风干（几个小时到过夜）。
- 在室温下存放在玻璃盖盒垫。
- DNA溶液的针装载机：
在中间明火加热，并迅速拉至约两倍的长度从100μL的毛细管针装载机。 毛细管冷却后的两半分开被抢购。库存10-20注射针头装载机。商店直立的离 心管架。谨慎使用不刺穿自己点。 - 进行显微注射针：
针是由一个特殊的毛细管，其中包含一个内部的玻璃纤维长丝作为DNA溶液的灯芯。这些都是拉一针拉拔机上。我们用一个Narishige PP - 830拉拔，热定型的24.8。几个针拉的时间和存储在一个小塑料盒。多针，可随时“装”上的橡皮泥地带长期储存。 - 针尖“断路器”：
的显微注射针的尖端拉那么细，它实际上是在它的封闭式，并应使用玻璃盖的小碎片，破开。这些都是准备纸巾包裹在一个18 × 18毫米的玻璃盖，轻轻施加压力，直到它断裂成几件。一个有用的大小的碎片大约有3 x 4毫米。 - 野生型蠕虫（N2），成长到成年早期阶段使用的标准程序6注射。准备约100正确上演蠕虫/构造注入。
程序
- 打开主阀是连接到一个微量注射针臂和支架的氦罐。关闭调节阀，让气体进入线，使35磅的压力。注意使用脚踏板，可以释放的气体。
- 一针器插入到一个标准口pipetter管（玻璃毛细管的容器中），并制定了少量的质粒混合物（1μL）。
- 针器小心放入后端的注射针头，轻轻插入方式通过的长度针，直到阻力感觉。轻轻吹驱逐的DNA溶液，然后取出装载机。
- 显微注射的手臂插入针头，小心地放置在小的内部橡胶垫片。
- 放在琼脂板上的一个边缘的玻璃盖针破陶片。盖的碎片，以及琼脂板的整个表面，与卤烃油。将倒置显微镜舞台上的琼脂垫。
- 查看使用4X的目标和明视场照明领域的中心针的位置，但还没有降低进油。此外，中心盖在玻璃碎片的内缘的位置，然后专注于IT（仍在使用4X目标）。下入油针，将玻璃盖的碎片一样焦平面。提高放大倍率切换到40X目标。重新碎片的边缘，如果有必要重新定位针尖。
- 要开拓尖端的注射针头，轻轻地轻推针对盖玻璃碎片的边缘，而在同一时间，采用短脉冲的气体通过脚踏板。中针会充分破开液体的小水滴时逃脱针年底的。多余的液体流动，由于过大开幕，是不可取的，因为它会杀死动物。
- 从舞台删除琼脂板，提高了针，但不改变X或Y轴位置。滑动阶段，从下面的针，取出琼脂垫，并将其放置到在解剖显微镜。垫转移到一种蠕虫病毒，油面以下。如果蠕虫蠕动，轻轻抚摩它，直到它接触琼脂垫。潮湿的蠕虫，要坚持干琼脂糖。
- 注塑
- 快速放置搬上舞台的琼脂垫背面，中心视野的蠕虫病毒。
- 下针到蠕虫的同一平面上的重点。
- 霍夫曼照明（对比度过滤器的类型）过滤器切换。这使得蠕虫的形态细节成为可见。如果Nomarski / DIC光学上倒置的范围，将工作以及。使用40X的目标，着眼于“颗粒感”合胞中心的蠕虫病毒性腺生殖核下方的“蜂窝”模式，选择定位于一侧面临的针虫的性腺是。
- 微调针的位置，直到针尖还重点（性腺的“颗粒感”同一平面）。
- 轻轻插入针和性腺中心申请的气体压力驱逐到性腺手臂液滴的DNA或两个简短的脉冲。你应该观察整个远端性腺的液体传播的波。不要以为更多的液体是更好，因为过多的液体流入近端性腺手臂弯曲，可以关闭卵母细胞生产。如果可能的话，根据蠕虫的位置上，以同样的方式注入其他性腺手臂。
- 重要的是迅速开展工作，同时注入了一种蠕虫病毒，它可以很容易变干。注入第二性腺臂的决定后的速度有多快，你可以重新定位针和蠕虫依赖。整个过程应该最好少于1-2分钟。
- 从舞台上拆下的玻璃盖，放在解剖范围。应用上直接注入蠕虫（22MM KH 2 PO 4，42mm的NA 2 HPO 4，85MM氯化钠，1MM 硫酸镁 ）M9的缓冲液加入1μl（这可能需要淹没的卤烃油的表面下面的枪头）。缓冲区应补充水分的蠕虫病毒，然后将浮琼脂糖垫表面。蠕虫传输到正规板使用了蠕虫挑。琼脂糖垫可重复使用数次，直到它已成为缓冲区和蠕虫不再坚持过于饱和。
转基因选择
- 注入蠕虫中，P 0代，被转移到个人新鲜，细菌接种板（60毫米），并允许重现。通常情况下，注入动物孵育2-3天，直到后代出现在20 ° C。
- 的F 1后代观察转基因标记用荧光体视显微镜（如荧光）的证据。每个荧光，载波F 1，动物分别克隆到一个新的板块（因为每个F 1的后代，被认为是一个独特的行）。允许的F 1雌雄同体重现。 ，同样，这通常是在20 ° C为2-3天，直到后代出现。
- 观察以及转基因动物的F 2代。 F 2，继承和表达的转基因阵列的动物被认为是一个“稳定” 行。
注：在F 1日年龄有可能是很多的转基因动物，但他们并不稳定。 F 1的转基因动物的大多数人不会传播到F 2稳定线。
注意：要控制在基因的拷贝数变异，产生三个独立的每个构造注入稳定线的最低 。 - 每个独立的稳定线应保持作为一个单独的蠕虫。每一行可以传播几个转基因动物在每一代的新盘，这必须使用荧光体视显微镜，如果选择标记荧光。
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Discussion
执行此过程时，重要的是要记住：
- 直接注入到性腺中心
- 没有注入过多的液体
- 迅速开展工作，以防止dessication。
如果进针，如它被打破过大的问题，这是最好的改造，而不是试图以比不太理想的针注入新鲜针，。
代转基因蠕虫有许多应用，如：
- 突变基因的鉴定，在方法调用转化救援
- 截短蛋白的表达蛋白结构域的映射，通过
- 一个细胞和疾病的进程的基因的作用表征。
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Acknowledgments
我们要感谢考德威尔实验室所有成员的合作精神。运动障碍在实验室的研究已经得到了巴赫曼 - 斯特劳斯肌张力障碍及帕金森基金会，美国帕金森基金会，美国帕金森病协会，阿拉巴马州帕金森氏病协会，迈克尔J.福克斯帕金森病研究基金会，和本科生科研。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18x18 mm | Fisher Scientific | 12-548-A | ||
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22x50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR international | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | "Kwik-Fil" | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige International | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research, Inc. | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
- Brenner, S.
