Summary
סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.
Abstract
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי גנים במוח, בצינור העצבי, somite היווצרות primordia לב. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בהר 2 צבעים שלם הכלאה באתרו, ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. שנית, העובר עיבוד עבור prehybridization. העובר היא הכלאה אז עם שתי בדיקות שונות, אחת יחד לחפור, ואף אחד מצמידים את FITC. בעקבות הכלאה בין לילה, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים בשילוב לחפור. תגובת צבע על מצע DIG מבוצע, ואת האזור של עניין נראה כחול. העובר הוא מודגרות אז בשילוב עם נוגדנים FITC. העובר מעובד לתגובת צבע עם FITC, ואת האזור של עניין נראה אדום. לבסוף, העובר מקובע ומעובד phtograph ואת חתך. מדריך לפתרון בעיות מוצג גם.
Protocol
חלק 1: תיקון העוברים
- מלאו צלחת דיסקציה עם קרח קר depc-PBS. שמור על הקרח. פתח את הביצה על ידי הקשה על פגז עם מלקחיים ולהסיר חתיכות הקליפה.
- הסר עבה אלבומין עם מלקחיים. הטיה שק חלמון עם מלקחיים גס כל כך העובר הפונה כלפי מעלה.
- בעזרת מספריים לחתוך ריבוע של שק חלמון סביב העובר.
- בעזרת כף, להסיר העובר מן החלמון ומניחים על קרח קר depc-PBS.
- מתחת למיקרוסקופ, להסיר ממברנות חלמון ולהעביר לצלחת קיבעון.
- הצמד מטה, להסיר depc-PBS. החלף PFA 4% ב-PBS depc ולתקן O / N ב 4 ° C.
- הסר מקבע. החלף עם קרח קר depc-PBS. באמצעות מחט סוף בוטה microcapillary או סכין microdissection, לחרר את מערכת העצבים ואת החללים בלב, כדי למנוע השמנה של בדיקה.
- לשטוף 2x 10 mn depc-PBS עם 0.1% Tween-20 (PBT). מייבשים 10 mn כל אחד 25%, 50%, 75% מתנול PBT. מייבשים עוברים פעמיים מתנול 100%. חנות ב -20 מעלות צלזיוס מתנול.
חלק 2: Prehybridization
- רעננותם עוברים 10 mn כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBT. לשטוף 2x 10 mn ב PBT.
- בינתיים, להכין מקבע קרים (paraformaldehyde 4% PBT). החלף PBT עם פתרון K proteinase (3 מ"ל / בקבוקון; [? 5 גרם / מ"ל] הסופי PBT). ודא את הבקבוקון כולו חשוף הפתרון K proteinase ידי בעדינות מגלגלים את הבקבוקון, ראה פתרון בעיות עבור זמני חשיפה.
- באמצעות RNase חינם פיפטה פסטר להסיר proteinase K ולהוסיף מקבע (2 מ"ל). מיד מקום על קרח בדיוק 20 mn.
- שוטף כל RT מבוצעות על nutator. לשטוף 2x 10 mn ב PBT, ו 1x 10mn ב PBT המכילות חיץ הכלאה של 50%.
- לשטוף 1x במאגר הכלאה. לדגור על 65 מעלות צלזיוס חוצץ 2 מ"ל הכלאה של 4-5 שעות.
חלק 3: עוברים להכליא עם בדיקות
- לחפור FITC סינתזה בשילוב בדיקה מתואר בנספח. החללית צפויה לתת איתות חזק, צריך להיות עם synhesized FITC המכילים נוקלאוטידים; בדיקה חלש צריך להיות מסונתז עם עם DIG המכילים נוקלאוטידים.
- בדיקות Prewarm במאגר הכלאה (500 ng / ml כ"א) באמצעות בקבוקון 2 מ"ל. מיד להחליף את החיץ הכלאה עם פתרון בדיקה. אל תתנו עוברים יבש. דגירה של 16 שעות ב 65 ° C.
- החלף בדיקה עם חיץ הכלאה, 2 שוטף, כל 30 mn ב 65 ° C. שטפי 15 mn במאגר הכלאה / MABT (1 / 1 v / v /) בשעה 65 ° C.
חלק 4: הדגירה DIG נוגדן וצבע תגובה
- לשטוף 2x20 mn ב MABT. שטפי 1 שעות ב 2% BBR / MABT. לשטוף 5 שעות ב -2% BBR/20% היס / MABT (חסימת חיץ). דגירה של נוגדנים DIG 1:2000 מדולל חיץ חסימה, O / N ב 4 ° C על nutator.
- לשטוף 3x 10 mn כל MABT, ואת שעות 3x 1 כל MABT.
- לשטוף 2x 20 mn ב NTMT. הוסף NBT / BCIP המצע 200ul כדי NTMT 10 מ"ל. מיד להסיר NTMT מבקבוקון ולהחליף חיץ 1-2 NBT / BCIP מ"ל. מקום חשוך. צג התגובה צבע אחרי 20 mn, ובו 20 מרווחי mn לאחר מכן.
- בעקבות התגובה צבע (אמור להופיע כחול), להתרחץ PBS עבור 10 mn, להצמיד על צלחת קיבוע מלא PBS, ולהחליף פתרון עם PFA 4% ב-PBS. תקן O / N ב 4 ° C.
- העברה בקבוקון scintillation חדש. שטפי ב PBST (PBS עם 1% Tween-20) 2x10 mn. שטפי ב MABT 2x 10 mn.
- מדגירים את MABT 30 mn ב 63 ° C.
חלק 5: הדגירה נוגדן FITC וצבע תגובה
- לשטוף 2x 10 mn ב MABT, 1 שעות ב 2% BBR / MABT, 5 שעות במאגר חסימת
- דגירה של אלקליין phosphatase מצמידים אנטי FITC-נוגדן (1:500) O / N ב 4 ° C.
- לשטוף 3x 10 mn כל MABT, ואת שעות 3x 1 כל MABT.
- שטפי ב 2x 20 mn ב TBS pH 8.45% עם 0.1 Tween-20 (TBST).
- הכן וקטור האדום פתרון עובד (5 מ"ל) ב TBST באמצעות ריאגנטים 1,2 ו 3 המסופק בערכה. מיד להסיר TBST מבקבוקון ולהחליף חיץ האדום וקטור. מקום חשוך. צג התגובה צבע אחרי 40 mn, ובו 30 מרווחי mn לאחר מכן.
- צבע בעקבות התגובה (אמור להופיע אדום), עוברי העברה PBS.
חלק 6: קיבוע ועיבוד
- העברה צלחת קיבעון המכיל PBS, ולתקן PFA ב -4% במשך 20 mn ב RT או O / N ב 4 ° C.
- שטפי ב-PBS, 2x 10 mn. כדי תהליך הצילום, להעביר גליצרול 20% PBS (זו יהפכו את העוברים שקוף). כדי ליצור חדר, לחתוך 2 רצועות של סרט PVC, להרכיב אותם בשקופית. גזור ריבוע במרכז באמצעות להב. הסר את מלקחיים באמצעות מרובע.
- כדי תהליך חתך שעווה, להעביר בחזרה PBS, לשטוף 2x 10 mn, מייבשים בסדרה מדורגת של מתנול (25%, 50%, 75% ו 100% ב-PBS, 10 mn כל אחד).
- החלף propanol, 3mn. החלף 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, ואחריו 20 mn ידי Histoclear (2x 1 שעות). החלף histoclear / שעווה 01/01 (v / v) 60 ° C עבור 1 שעה. החלף בשעווה תהליךעבור היסטולוגיה.
חלק 7: פתרונות
חיץ הכלאה, בכל חנות -20 מעלות צלזיוס פלקון, 50 מ"ל: 25 מ"ל לפוראמיד; 3.25 מ"ל (20xSSC); 0.5 מ"ל (EDTA 0.5m); 1 מ"ל (10% Tween-20); 2.5 מ"ל (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA). 100ul (50 מ"ג / מ"ל הפרין) MABT, להכין חומצה maleic 100mm; pH עד 7.5 עם NaOH כדורי. הוסף 150mm NaCl ו - 0.1% Tween-20.
NTMT (עשה רק לפני השימוש), 50 מ"ל: 1ml (NaCl 5M); 2.5 מ"ל (טריס-2M HCl pH9.5); 1.25 מ"ל (2M MgCl 2); 5 מ"ל (10% Tween-20).
TBST: טריס-HCl 0.1M, 0.15M NaCl, pH 8.45, 0.1% Tween-20.
חלק 8: פתרון בעיות
| בעיה | לגרום | תרופה |
|---|---|---|
| העובר מכורבלת | התייבשות התייבשות מספיק / | שמור על 10 מרווחי mn במהלך התייבשות / התייבשות צעדים רצופים |
| אין אות בדיקה | בדיקה נפגעת זיהום RNase בבקבוקון | הפעל בדיקה על 1% agarose ג'ל ודא את הבקבוקון כולו חשוף הפתרון K proteinase בשלב 2 |
| בדיקה היא תוויות חללים הלב בצינור העצבי | בדיקה לכוד | בשלב 2, ודא חללים כל microdissection מחורר באמצעות סכין או microcapillary |
| העובר התפרקה הכלאה הבא (שלב 3) | צעד proteinase K שמאל טמפרטורה הכלאה זמן רב מדי הוא גבוה מדי | Proteinase K אסור להשאיר יותר 1mn (שלבים 3 + ו 4), 2 mn (שלב 5 עד 7), 3 mn (שלב 80-10), 4 mn (שלב 11-13) אל להכליא ב T o גבוה מ 65 מעלות צלסיוס |
חלק 9: תוצאות נציג
עוברים נציג מוצגים להלן: (א) העובר (בשלב HH7) התווית בדיקה DIG-סוקס (כחול) לבין FITC-delta-1 בדיקה (אדום). (ב) העובר (בשלב HH8) התווית בדיקה DIG-Pax6 (כחול) בדיקה FITC-ששש (אדום). NF, עצביים לקפל, ANP, צלחת עצביים PSM הקדמי, והמזודרם presomitic, n, notochord, nt, בצינור העצבי). בדיקה מתנות במעבדות של בני הזוג. ג תבין, מ Goulding, ד אנריקה, וג' בריסקו. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הר 2 צבעים כולו בשיטת הכלאה באתרו משמש כדי לקבוע הן תבניות במרחב ובזמן של ביטוי גנים, תוך שימוש באחד או שני גנים של עניין. היישומים כוללים הערכת דפוסי ביטוי גנים של גנים הרומן (למשל 1,2, כמו גם שינויים עלבון גן הביטוי הבא (מניפולציות עובריים 3, 4 חרוזים, ו electroporation של רנ"א או דנ"א בונה 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
