Summary
मस्तिष्क के ऊतकों की सेलुलर विविधता chromatin है क्योंकि ज्यादातर assays एकल कक्ष संकल्प की कमी में epigenetic चिह्नों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा बन गया है. न्यूरॉन्स आमतौर पर glia और अन्य गैर neuronal कोशिकाओं के साथ intermingled हैं. हम एक प्रोटोकॉल को निकालने और मानव मस्तिष्क से neuronal नाभिक इकट्ठा प्रदान करते हैं.
Abstract
मानव मस्तिष्क में न्यूरॉन्स postmitotic मोटे तौर पर जन्म के पूर्व का विकास के दौरान, बन गया है और इस प्रकार पूर्ण जीवन भर उनके नाभिक बनाए रखने के. हालांकि, neuronal chromatin और परमाणु संगठन में विकास और उम्र बढ़ने के दौरान परिवर्तन, या पुरानी neuropsychiatric बीमारी में थोड़ा के बारे में जाना जाता है. हालांकि, सबसे chromatin और डीएनए आधारित कमी (मछली की तुलना में) एक सेल संकल्प assays तिथि करने के लिए. यह अंत करने के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों की काफी सेलुलर विविधता एक महत्वपूर्ण सीमा बन गया है, क्योंकि न्यूरॉन्स की आम तौर पर विभिन्न subpopulations glia और अन्य गैर neuronal कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के के साथ intermingled कर रहे हैं. एक संभव समाधान के लिए सेल प्रकार विशिष्ट संस्कृतियों बढ़ने के लिए हो सकता है, लेकिन सबसे न्यूरॉन्स सहित सीएनएस की कोशिकाओं, पूर्व स्थायी vivo हैं, केवल कुछ ही हफ्तों के लिए, सबसे अच्छा में है और इस प्रकार epigenetic तंत्र के लिए एक अधूरा मॉडल संभावित पूर्ण जीवन भर ऑपरेटिंग प्रदान करेगा . यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल को निकालने और जमे हुए (कभी नहीं तय) मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क से नाभिक शुद्ध प्रदान करते हैं. विधि hypotonic lysis बफर में नाभिक के निष्कर्षण, और विरोधी NeuN एंटीबॉडी के साथ ultracentrifugation immunotagging द्वारा पीछा शामिल है. लेबल neuronal नाभिक तो अलग से एकत्र कर रहे हैं प्रतिदीप्ति सक्रिय छँटाई का उपयोग. इस विधि प्रजातियों में से एक विस्तृत श्रृंखला में किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र के लिए लागू है और के साथ साइट और संशोधन विशेष विरोधी histone एंटीबॉडी, और डीएनए मेथिलिकरण और अन्य assays के लिए chromatin immunoprecipitation अध्ययन के लिए उपयुक्त होना चाहिए.
Protocol
नाभिक निकालना
- 5 एमएल lysis एक बफर में एक douncer में जमी शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों के 250 मिलीग्राम और रखो बर्फ पर यह जगह . FACS छँटाई के बाद 5 लाख नाभिक को प्राप्त करने के लिए, हम आम तौर पर नमूना प्रति ऊतक के 1000 मिलीग्राम का उपयोग करें.
- एक बार ऊतक thawed है, जबकि बर्फ पर 1 मिनट के लिए ऊतक dounce.
- Homogenized ऊतक ले लो और यह एक 15 एमएल स्पष्ट ultracentrifuge एक ट्यूब में जगह. बर्फ पर ट्यूब रखो.
- Sucrose 2 समाधान के एक विंदुक के साथ 9 एमएल लो, स्पष्ट ultracentrifuge एक ट्यूब के नीचे डाल विंदुक और Sucrose 2 समाधान रिहाई Sucrose 2 समाधान के शीर्ष पर homogenized ऊतक समाधान के साथ एक एकाग्रता ढाल बना.
- Ultracentrifuge ट्यूबों का वजन करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे सभी जबकि ultracentrifuge भीतर घूर्णन संतुलित हो जाएगा. ऊपर परत करने के लिए lysis एक बफर जोड़कर वजन करने के लिए किसी भी समायोजन करें.
- बाद ट्यूबों तौला गया है, रोटर बाल्टी में उन्हें जगह है.
- SW28 रोटर में सभी बाल्टी प्लेस और ध्यान से ultracentrifuge में रोटर जगह.
- 107163.6 आरसीएफ में 2.5 घंटे के लिए 4 नमूने ultracentrifuge डिग्री सेल्सियस
- एक बार centrifugation पूरा हो गया है, सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, साथ एकाग्रता ढाल पर पाया मलबे की परत के साथ, एक निर्वात का उपयोग के साथ, जबकि ट्यूब के नीचे नाभिक युक्त गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है.
- प्रत्येक गोली 1X पीबीएस के 500 μL जोड़ें और 20 मिनट के लिए बर्फ पर बैठ. यह गोली अपने दम पर एक छोटे से भंग करने के लिए, यह आसान बाद यंत्रवत् इसे pipetting और नीचे है, जो तनाव की मात्रा नाभिक अनुभव कम से भंग बना देता है.
- बाद नाभिक 20 मिनट के लिए बर्फ पर incubated है, यंत्रवत् विंदुक और नीचे करने के लिए पूरी तरह से 1XPBS भीतर नाभिक भंग.
- Ultracentrifuge ट्यूब से समाधान नाभिक युक्त निकालें और एक एकल 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में दो नलियों की सामग्री गठबंधन. फिर, बर्फ पर नमूने जगह है.
FACS के लिए Immunostaining
- इस बिंदु पर, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के एक immunostaining बना मिश्रण बनाने के लिए, और मिक्स अवरुद्ध. प्रत्येक नमूने के लिए, 1XPBS NeuN एंटीबॉडी, अवरुद्ध मिक्स है, जो में 0.5% BSA और 10% सामान्य 1XPBS में बकरी सीरम, और Alexa Fluor 488 की 1 μL शामिल 100 μL 1.2 μL युक्त 300 μL गठबंधन. नियंत्रण नमूने के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी NeuN बाहर और, बजाय, बस और अधिक 1XPBS जोड़ने.
- भंवर immunostaining और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं.
- जबकि धुंधला मिश्रण incubating है, नमूने के लिए नियंत्रण कर. FACS छँटाई, एक नमूना है, जिसमें अकेले नाभिक के लिए कहा जाता है, "अस्थिर" नियंत्रण की जरूरत है, एक दूसरा नमूना, एक नकारात्मक नियंत्रण, माध्यमिक एंटीबॉडी Alexa 488 Fluor बिना प्राथमिक एंटीबॉडी NeuN भी जरूरत है के साथ नाभिक युक्त.
- विभाज्य 2 एमएल microcentrifuge एक और 2 एमएल नकारात्मक नियंत्रण के लिए 1XPBS के 980 उल युक्त ट्यूब में अस्थिर नियंत्रण के लिए 1XPBS, और एक और 20 μL युक्त ट्यूब में समाधान युक्त नाभिक के 20 μL. के नाभिक मात्रा युक्त नमूना वापस 1XPBS साथ 1 एमएल उठाएँ. सभी नमूनों वापस बर्फ पर रखा जाता है.
- अब जब कि immunostaining मिश्रण incubating समाप्त हो गया है, उचित नमूने में 401 μL की अपनी सामग्री को जोड़ने. नाभिक नमूना दोनों NeuN और alexa Fluor 488 युक्त मिश्रण प्राप्त करते हैं, जबकि नकारात्मक नमूना केवल माध्यमिक एंटीबॉडी Alexa 488 Fluor युक्त मिश्रण प्राप्त होगा.
- 45 मिनट के लिए अंधेरे में बारी बारी से ठंडे कमरे में नमूने ले लो.
- के बाद नमूने अंधेरे में 45 मिनट के लिए incubated है, उन्हें बर्फ पर रख दिया और उन्हें FACS सुविधा के लिए लाने. FACS सुविधा के लिए परिवहन के दौरान, नमूने और बर्फ पर अंधेरे में रखा जाना चाहिए.
FACS
- FACS सुविधा में, एक 40 उम फिल्टर के माध्यम से नमूने फिल्टर. फिर, उन्हें कुछ मिनट के लिए साधन के माध्यम से चलाने के लिए, जबकि ठंड रखा जा रहा है, क्रम में सॉर्ट करने से पहले कुछ प्रारंभिक डेटा प्राप्त.
- इस बिंदु पर, यह आवश्यक है के लिए उपयुक्त फाटक छँटाई के लिए आवश्यक सेट. कई अलग फाटक सॉर्ट नमूने के लिए उपयोग किया जाता है. पहले गेट अलग नमूना भीतर पाया नाभिक के आकार के एक विचार देता है, और वास्तविक नाभिक से मलबे के separatation की अनुमति देता है है. दूसरे गेट हमें नाभिक सॉर्ट करने के लिए व्यक्तिगत अनुमति देता है. त्यागें किसी समुच्चय में इस बिंदु पर खारिज कर रहे हैं. अंत में, तीसरे फाटक एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति तरंग दैर्ध्य के लिए सेट कर दिया जाता है, मिलान fluorochrome की है कि हमारे माध्यमिक एंटीबॉडी में पाया. इस फाटक रखकर हमें सॉर्ट करने के लिए अनुमति देता है और अलग NeuN +, इसलिए NeuN से neuronal नाभिक नाभिक.
- सभी फाटकों के बाद चुना जाता है, नाभिक 1XPBS में हल किया जा सकता है है.
- एक बारपूरे नमूना के माध्यम से चला गया है, साधन के माध्यम से सॉर्ट किया गया नमूना के एक विभाज्य चलाकर तरह की शुद्धता की जाँच करें. सुनिश्चित करें कि नमूना प्रतिदीप्ति नहीं फैला है, बल्कि एक एकल वृत्त का चतुर्थ भाग के भीतर निहित है. यह सबसे अच्छा है नमूने जो 90% से अधिक शुद्ध हैं चुनने.
FACS के बाद
- एक बार नमूना हल किया गया है, नाभिक के प्रसंस्करण कर सकते हैं शुरू. सॉर्ट किया गया नमूना के 10 एमएल ले लो और यह करने के लिए Sucrose 2 समाधान, 1M CaCl 2 के 50 उल और 1m (ऐस) मिलीग्राम 2 के 30 उल 2 एमएल जोड़ने . एक अनुस्मारक के रूप में, हमेशा के लिए बर्फ पर नमूना रखने के बाद से नाभिक unfixed हैं सुनिश्चित हो.
- यदि सॉर्ट किया गया नमूना कम से कम 10 एमएल, मात्रा बढ़ा 1XPBS जोड़कर 10 एमएल के लिए, या अतिरिक्त सामग्री तदनुसार समायोजित.
- नमूना 15 मिनट के लिए बर्फ पर कई बार और जगह उलटें.
- बाद नमूनों 15 मिनट के लिए बर्फ पर incubated है, उन्हें एक स्विंग बाल्टी रोटर में 1786 आरसीएफ में 4 बजे 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- एक निर्वात का उपयोग के साथ सतह पर तैरनेवाला सफेद गोली ट्यूब के नीचे पाया परेशान बिना, त्यागें.
- जो भी समाधान आप प्रयोगों के लिए आगे बढ़ने की आवश्यकता के 200 μl में गोली भंग, और ऊपर और नीचे विंदुक.
- एक छोटे से ट्यूब में समाधान स्थानांतरण और इसे आगे उपयोग तक -80 ° सी फ्रीजर में जगह है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल neuronal chromatin के epigenetic परिवर्तन और, और अधिक सामान्यतः पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी होना चाहिए, सामान्य विकास और उम्र बढ़ने, या स्नायविक या मानसिक बीमारी के दौरान neuronal नाभिक के आणविक phenotype पर. पद्धति का विशेष लाभ की है जब मस्तिष्क के ऊतकों के सेलुलर विविधता उम्र बढ़ने के दौरान न्यूरॉन को glia राशन में संभावित बदलाव या रोग के कारण सहित एक चिंता का विषय हैं 1 . उदाहरण के लिए, chromatin immunoprecipitation तकनीक के साथ मौजूद छँटाई प्रोटोकॉल के संयोजन के द्वारा, हम हाल ही में मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) जीन प्रमोटर में न्यूरॉन विशेष histone मेथिलिकरण पैटर्न का वर्णन है, और अतिरिक्त neuronal जीनों के लिए 2. ऐसा ही एक विधि पहले इस्तेमाल किया गया था पूर्वव्यापी जन्म 3 डेटिंग के लिए वयस्क मस्तिष्क प्रांतस्था से न्यूरॉन्स इकट्ठा . छँटाई तकनीक भी माउस मस्तिष्क में 2 नियोजित किया गया था, और क्योंकि के नाभिक में स्थिरता के जमे हुए तो thawed ऊतक, हम आशा करते हैं कि यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण प्रजातियों में से एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है. है क्योंकि के लिए के रूप में छोटा रूप में 10,000 कोशिकाओं से chromatin immunoprecipitation अब एक अधिक व्यापक जीनोम 4 कवरेज के लिए भी संभव है, यह संभव हो सकता है के लिए बहुत सामग्री है कि हम इसके बाद के संस्करण की सिफारिश शुरू की 1000 मिलीग्राम से भी कम का उपयोग कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
लेखकों को सलाह और तकनीकी सहायता फ्लो Cytometry कोर सुविधा में मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल के विश्वविद्यालय में डॉ. रिचर्ड Konz और कर्मचारियों द्वारा प्रदान की सराहना करते हैं. कोर मधुमेह इन्डोकिरनोलाजी अनुसंधान केंद्र अनुदान DK032520 द्वारा समर्थित संसाधनों का भी इस्तेमाल किया गया. इस काम के मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIMH), नशीली दवाओं के सेवन के राष्ट्रीय संस्थान (NIDA) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और मानव विकास से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
Reagents:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
.jpg
){kind=link}