Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Summary

L'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.

Abstract

Neuroni nel cervello umano si postmitotic in gran parte durante lo sviluppo prenatale, e quindi mantenere la loro nuclei per tutta la durata della vita piena. Tuttavia, poco si sa sui cambiamenti neuronali e organizzazione della cromatina nucleare durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento, o in malattie croniche neuropsichiatrici. Tuttavia, ad oggi i test basati la maggior parte della cromatina e DNA (esclusi quelli di pesci) risoluzione mancanza singola cellula. A tal fine, la notevole eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa, perché di solito diverse sottopopolazioni di neuroni sono mescolati con diversi tipi di cellule gliali e di altre cellule non neuronali. Una possibile soluzione sarebbe far crescere specifiche culture di cellule-tipo, ma la maggior parte delle cellule del SNC, tra cui i neuroni, sono ex vivo sostenibile, nella migliore delle ipotesi, solo per poche settimane e quindi avrebbe fornito un modello incompleto per meccanismi epigenetici potenzialmente operanti in tutto il ciclo di vita completo . Ecco, mettiamo a disposizione un protocollo per estrarre e purificare i nuclei da congelati (non fisso) del cervello umano post-mortem. Il metodo prevede l'estrazione dei nuclei in tampone di lisi ipotonica, seguita da ultracentrifugazione e immunotagging con anticorpi anti-NeuN. Etichettati nuclei neuronali vengono poi raccolti separatamente utilizzando la fluorescenza-attivato ordinamento. Questo metodo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi regione del cervello in una vasta gamma di specie e adatto per gli studi di immunoprecipitazione della cromatina con il sito-specifici e modifica-anticorpi anti-istoni, e per la metilazione del DNA ed altri test.

Protocol

Nuclei di estrazione

1. Mettere 250 mg di tessuto cerebrale post-mortem congelato in 5 ml di Lysis Buffer ¹ in douncer e posizionarlo sul ghiaccio. Per ricevere circa 5 milioni di nuclei dopo FACS ordinamento, useremo 1000 mg di tessuto per campione.
2. Una volta che il tessuto si è scongelato, dounce il tessuto per 1 minuto, mentre sul ghiaccio.
3. Prendete il tessuto omogeneizzato e posizionarlo in un tubo da 15 ml ultracentrifuga chiaro. Mettere la provetta in ghiaccio.
4. Prendere 9 mL di soluzione di saccarosio ² con una pipetta, mettere la pipetta sul fondo della provetta ultracentrifuga chiaro, e rilasciare la soluzione di saccarosio ² per creare un gradiente di concentrazione con la soluzione del tessuto omogeneizzato in cima alla soluzione di saccarosio ^2.
5. Pesare i tubi ultracentrifuga per assicurarsi che saranno tutti bilanciati durante la rotazione all'interno del ultracentrifuga. Apportare eventuali modifiche al peso con l'aggiunta di Lysis Buffer ¹ al livello superiore.
6. Dopo che i tubi sono stati pesati, li posto in secchi del rotore.
7. Mettere tutti i secchi in un rotore SW28 e con attenzione il rotore posto in ultracentrifuga.
8. Ultracentrifuga i campioni a 107.163,6 RCF per 2,5 ore a 4 ° C.
9. Una volta che la centrifugazione, rimuovere il supernatante, insieme con lo strato di detriti trovati al gradiente di concentrazione, con l'uso di un vuoto, facendo attenzione a non disturbare il pellet contenente i nuclei sul fondo della provetta.
10. Aggiungere 500 ml di PBS 1X a ciascun pellet e lasciate riposare in ghiaccio per 20 minuti. Questo permette al pellet per sciogliere un po 'da sola, rendendo più facile per poi meccanicamente sciogliere pipettando su e giù, che riduce la quantità di stress dell'esperienza nuclei.
11. Dopo i nuclei sono incubati in ghiaccio per 20 minuti, meccanicamente pipetta su e giù per sciogliere completamente i nuclei all'interno 1XPBS.
12. Rimuovere i nuclei contenenti soluzione dai tubi ultracentrifuga e combinare il contenuto di due tubi in un unico tubo di 2 ml microcentrifuga. Ancora una volta, posto i campioni sul ghiaccio.

Immunocolorazione per FACS

1. A questo punto, fare una miscela composta immunocolorazione di anticorpi primari e secondari, e blocco Mix. Per ogni campione, unire 300 ml di 1XPBS contenente 1,2 ml di anticorpi NeuN, 100 ml di miscela di blocco, che contiene 0,5% di BSA e il 10% siero di capra normale in 1XPBS, e 1 ml di Alexa Fluor 488. Per i campioni di controllo, escludere la NeuN primario di anticorpi e, invece, è sufficiente aggiungere altre 1XPBS.
2. Vortex la miscela immunocolorazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
3. Mentre la miscela colorazione è in incubazione, fanno i controlli per i campioni. Per FACS ordinamento, un campione, che contiene nuclei sola, chiamata "controllo senza macchia" è necessario, un secondo campione, un controllo negativo, che contiene i nuclei con l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 senza il NeuN anticorpo primario è anche necessario.
4. Aliquota 20 l di nuclei che contiene la soluzione in una provetta contenente 2 ml 1XPBS per il controllo senza macchia, e un altro 20 l in un altro tubo da 2 ml contenente 980 uL di 1XPBS per il controllo negativo. Aumentare il volume dei nuclei contenenti campioni di nuovo fino a 1 ml con 1XPBS. Tutti i campioni sono posti di nuovo sul ghiaccio.
5. Ora che la miscela immunocolorazione ha finito di incubazione, aggiungere il suo contenuto di 401 microlitri in campioni appropriati. Il campione nuclei riceverà la miscela contenente sia NeuN e Alexa Fluor 488, mentre il campione negativo riceverà la miscela contenente solo l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488.
6. Prendete i campioni nella stanza fredda per ruotare al buio per 45 minuti.
7. Dopo che i campioni sono incubati al buio per 45 minuti, metterli su ghiaccio e portarli alla struttura FACS. Durante il trasporto verso l'impianto FACS, i campioni devono essere tenuti sul ghiaccio e al buio.

FACS

1. Presso l'impianto di FACS, filtrare il campione attraverso un filtro di 40 um. Poi, li attraversano lo strumento per pochi minuti, pur essendo tenuti a freddo, al fine di ottenere alcuni dati preliminari prima della cernita.
2. A questo punto, è necessario impostare le porte appropriate richieste per l'ordinamento. Diverse porte differenti sono usati per i campioni sorta. Il primo cancello dà un'idea delle dimensioni dei nuclei diversi trovato all'interno del campione, e permette separatation di detriti da nuclei reali. La seconda porta ci permette di ordinare i nuclei singolarmente. Scartare qualsiasi aggregati vengono scartate a questo punto. Infine, la terza porta è impostata su una specifica lunghezza d'onda di fluorescenza, equivalente a quella del fluorocromo trovato nel nostro anticorpo secondario. Ponendo questa porta ci permette di ordinare e + NeuN separati, quindi nuclei neuronali da NeuN - nuclei.
3. Dopo che tutti i cancelli sono stati scelti, i nuclei possono essere ordinate in 1XPBS.
4. Una volta che ilintero campione è passato attraverso, verificare la purezza del genere eseguendo una aliquota del campione ordinati attraverso lo strumento. Assicurarsi che la fluorescenza del campione non si sviluppa, ma è contenuta all'interno di un quadrante singolo. E 'meglio scegliere i campioni che sono oltre il 90% puro.

Dopo FACS

1. Una volta che il campione è stato ordinato, il trattamento dei nuclei può cominciare. Prendere 10 ml di campione ordinati e aggiungere ad esso 2 mL di soluzione di saccarosio ^2, 50 uL di 1M CaCl ₂ e 30 ul di 1m Mg (Ace) _2. Come promemoria, sempre essere sicuri di mantenere il campione in ghiaccio in quanto i nuclei sono non fissata.
2. Se c'è meno di 10 ml di campione ordinati, alzare il volume fino a 10 ml con l'aggiunta di 1XPBS, o regolare il materiale aggiuntivo di conseguenza.
3. Invertire il campione più volte e posto in ghiaccio per 15 minuti.
4. Dopo che i campioni sono incubati in ghiaccio per 15 minuti, le centrifughe in un rotore swing a 1786 RCF per 15 minuti a ⁴ ° C.
5. Eliminare il supernatante con l'uso di un vuoto, senza disturbare il pellet bianco trovato sul fondo della provetta.
6. Sciogliere il pellet in 200 ml di soluzione di qualunque avete bisogno per gli esperimenti di procedere, e pipetta su e giù.
7. Trasferire la soluzione in un tubo più piccolo e metterlo nel congelatore ° -80 C fino a quando un ulteriore uso.

Discussion

Il protocollo presentato qui dovrebbe essere particolarmente utile per gli studi focalizzati sui cambiamenti epigenetici della cromatina neuronale e, più in generale, sul fenotipo molecolare del nucleo neuronale, durante il normale sviluppo delle malattie e l'invecchiamento, o neurologici o psichiatrici. Il metodo è particolarmente vantaggioso quando l'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale, tra cui i potenziali cambiamenti nei neuroni-to-glia razione durante il corso di invecchiamento oa causa di malattia sono un problema ^1. Per esempio, combinando il protocollo attuale ordinamento con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina, abbiamo recentemente descritto neuroni specifici pattern di metilazione degli istoni il cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF), promotore del gene, e per altri geni neuronali ^2. Un metodo simile era stato usato precedentemente per raccogliere i neuroni dalla corteccia cerebrale per adulti nascita retrospettiva datazione ^3. La tecnica di selezione è stato impiegato anche nel cervello del mouse ^2, e per la stabilità dei nuclei in congelati-then-tessuto scongelato, prevediamo che l'approccio qui presentato è applicabile a una vasta gamma di specie. Perché immunoprecipitazione della cromatina da un minimo di 10.000 cellule per ora è fattibile anche per una copertura più completa del genoma ^4, può essere possibile utilizzare molto meno di 1000 mg di materiale di partenza che si consiglia di sopra.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water