Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Summary

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Abstract

Neurônios no cérebro humano se tornar pós-mitóticos em grande parte durante o desenvolvimento pré-natal, e assim manter seus núcleos em todo o ciclo de vida completo. No entanto, pouco se sabe sobre as alterações na cromatina nuclear neuronal e na organização durante o curso do desenvolvimento e envelhecimento, ou doença neuropsiquiátrica crônica. No entanto, a data mais cromatina e DNA ensaios com base (que não FISH) a falta de resolução única célula. Para este fim, a uma considerável heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa, porque normalmente várias subpopulações de neurônios são misturados com diferentes tipos de células gliais e outras células não-neuronais. Uma possível solução seria a crescer células tipo culturas específicas, mas a maioria das células do SNC, incluindo os neurônios, são ex vivo sustentável, na melhor das hipóteses, por apenas algumas semanas e assim proporcionaria um modelo incompleto de mecanismos epigenéticos potencialmente operacional em todo o ciclo de vida completo . Aqui, nós fornecemos um protocolo para extrair e purificar a partir de núcleos congelados do cérebro pós-morte (nunca fixo) humana. O método envolve a extração de núcleos em tampão de lise hipotônica, seguido por ultracentrifugação e immunotagging com anti-NeuN anticorpos. Rotulados núcleos neuronais são então recolhidos separadamente usando fluorescência ativado classificação. Este método deve ser aplicável a qualquer região do cérebro em uma ampla gama de espécies e adequado para estudos de imunoprecipitação de cromatina com local e modificação específica anticorpos anti-histonas, e para a metilação do DNA e outros ensaios.

Protocol

Extração de núcleos

1. Colocar 250 mg de tecido congelado cérebro pós-morte em 5 mL de Lise ^um tampão em um douncer e colocá-lo no gelo. Para receber cerca de 5 milhões núcleos após FACS triagem, geralmente usamos 1000 mg de tecido por amostra.
2. Uma vez que o tecido tem descongelado, Dounce o tecido por 1 minuto enquanto no gelo.
3. Pegue o tecido homogeneizado e colocá-lo em um tubo de ultracentrífuga 15 mL claro. Colocar o tubo em gelo.
4. Tome 9 mL da solução de sacarose ² com uma pipeta, coloque a pipeta no fundo do tubo de ultracentrífuga claro, e liberar a solução de sacarose ² para criar um gradiente de concentração com a solução de tecido homogeneizado em cima da solução de sacarose ^2.
5. Pesar os tubos de ultracentrífuga para se certificar de que todos eles vão ser equilibrada ao girar dentro da ultracentrífuga. Faça os ajustes para o peso pela adição de Tampão de Lise ¹ para a camada superior.
6. Após os tubos foram pesadas, colocá-los em baldes do rotor.
7. Coloque todos os baldes em um rotor SW28 e coloque cuidadosamente o rotor para a ultracentrífuga.
8. Ultracentrífuga as amostras em 107.163,6 RCF por 2,5 horas a 4 ° C.
9. Uma vez que a centrifugação for concluída, remova o sobrenadante, juntamente com a camada de detritos encontrados no gradiente de concentração, com a utilização de um vácuo, tomando cuidado para não perturbar o pellet contendo os núcleos na parte inferior do tubo.
10. Adicionar 500 mL de 1X PBS a cada pellet e deixe descansar na geladeira por 20 minutos. Isso permite que o pellet para dissolver um pouco por conta própria, tornando mais fácil para depois dissolvê-lo mecanicamente por pipetagem cima e para baixo, o que diminui a quantidade de estresse a experiência dos núcleos.
11. Após os núcleos têm incubadas no gelo por 20 minutos, mecanicamente pipeta cima e para baixo para dissolver completamente os núcleos dentro 1XPBS.
12. Remover a solução contendo núcleos dos tubos de ultracentrifugação e combinar o conteúdo de dois tubos em um único tubo de microcentrífuga 2 mL. Novamente, coloque as amostras em gelo.

Imunomarcação para FACS

1. Neste ponto, faça uma mistura composta imunomarcação do anticorpo primário e secundário, e Bloqueio Mix. Para cada amostra, combine 300 mL de 1XPBS contendo 1,2 mL de anticorpo NeuN, 100 mL da mistura de bloqueio, que contém BSA 0,5% e soro de cabra normal em 10% 1XPBS, e 1 mL de Alexa Fluor 488. Para as amostras controle, excluir a NeuN anticorpo primário e, em vez disso, basta adicionar 1XPBS mais.
2. Vortex da mistura imunocoloração e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente no escuro.
3. Enquanto a mistura de coloração é a incubação, fazer os controles para as amostras. FACS para triagem, uma amostra, contendo núcleos só, chamado de "controle sem mácula" é necessário, uma segunda amostra, um controle negativo, contendo os núcleos com o anticorpo secundário Alexa Fluor 488 sem o anticorpo primário NeuN também é necessário.
4. ML alíquota 20 dos núcleos contendo solução para um tubo de microcentrífuga contendo 2 mL 1XPBS para o controle sem manchas, e outro 20 mL para outro tubo de 2 ml contendo 980 uL de 1XPBS para o controle negativo. Aumentar o volume dos núcleos contendo amostra de volta até 1 mL com 1XPBS. Todas as amostras são colocadas de volta no gelo.
5. Agora que a mistura imunocoloração terminou incubação, adicione o seu conteúdo de 401 mL em amostras adequadas. A amostra núcleos receberão a mistura contendo ambos os NeuN e Alexa Fluor 488, enquanto a amostra negativa receberá a mistura contendo apenas o anticorpo secundário Alexa Fluor 488.
6. Tomar as amostras para a sala fria para rodar no escuro por 45 minutos.
7. Depois que as amostras têm incubadas no escuro por 45 minutos, colocá-los no gelo e trazê-los para a instalação FACS. Durante o transporte para a instalação FACS, as amostras devem ser mantidas no gelo e no escuro.

FACS

1. Na instalação FACS, filtro as amostras através de um filtro de 40 um. Então, executá-los através do instrumento por alguns minutos, enquanto sendo mantido frio, a fim de obter alguns dados preliminares antes da separação.
2. Neste ponto, é necessário definir as portas adequadas para a classificação. Várias portas diferentes são usados ​​para amostras tipo. O primeiro portão dá uma idéia do tamanho dos núcleos diferentes encontrados dentro da amostra, e permite separatation de detritos de núcleos reais. O segundo portão nos permite classificar os núcleos individualmente. Descartar qualquer agregados são descartados neste momento. Finalmente, o terceiro portão é definido para um determinado comprimento de onda de fluorescência, correspondente ao do fluorocromo encontrada na nossa anticorpo secundário. Colocando esse portão que nos permite classificar e + NeuN separado, portanto núcleos neuronais de NeuN - núcleos.
3. Depois de todas as portas são escolhidos, os núcleos podem ser classificados em 1XPBS.
4. Uma vez que oamostra total passou, verificar a pureza da espécie, executando uma alíquota da amostra classificadas através do instrumento. Certifique-se que fluorescence da amostra não se espalha, mas é contido dentro de um único quadrante. É melhor escolher amostras que são mais de 90% pura.

Depois FACS

1. Uma vez que a amostra foi classificada, o processamento dos núcleos pode começar. Tomar 10 mL de amostra classificados e adicionar-lhe 2 mL da solução de sacarose ^2, 50 uL de 1M CaCl ₂ e 30 ul de 1m Mg (Ace) _2. Como um lembrete, certifique-se sempre manter a amostra em gelo desde os núcleos são corrigidos.
2. Se houver menos de 10 mL de amostra classificados, aumentar o volume até 10 mL, adicionando 1XPBS, ou ajustar a materiais adicionais em conformidade.
3. Inverter a amostra várias vezes e colocar no gelo por 15 minutos.
4. Após as amostras terem incubado em gelo por 15 minutos, centrifugar-los em um balde de rotor swing em 1786 RCF por 15 minutos a ⁴ ° C.
5. Desprezar o sobrenadante com o uso de um vácuo, sem perturbar o sedimento branco encontrado na parte inferior do tubo.
6. Dissolver o sedimento em 200 mL de qualquer solução que você precisa para os experimentos de prosseguir, e pipetar cima e para baixo.
7. Transferir a solução para um pequeno tubo e colocá-lo no freezer -80 ° C até à sua utilização.

Discussion

O protocolo aqui apresentado deve ser particularmente útil para os estudos focados em mudanças epigenéticas da cromatina neuronal e, mais genericamente, sobre o fenótipo molecular do núcleo neuronal, durante a doença em desenvolvimento e envelhecimento, ou em condições normais neurológicos ou psiquiátricos. O método é uma vantagem particular quando a heterogeneidade celular de tecido do cérebro, incluindo mudanças potenciais no neurônio-glia de-ração durante o curso do envelhecimento ou devido a doenças são uma preocupação ^1. Por exemplo, através da combinação do protocolo de triagem presente com técnicas de imunoprecipitação de cromatina, que recentemente descrito neurônio-específica padrões de metilação das histonas no cérebro fator neurotrófico derivado promotor do gene (BDNF), e para genes adicionais neuronal ^2. Um método semelhante foi utilizado anteriormente para coletar os neurônios do córtex cerebral de adultos para o nascimento retrospectiva namoro ^3. A técnica de classificação foi empregado também no cérebro do rato ^2, e por causa da estabilidade dos núcleos congelados em-then-descongelado tecido, prevemos que a abordagem aqui apresentada é aplicável a uma grande variedade de espécies. Porque imunoprecipitação da cromatina de tão pouco como 10 mil células por agora é viável mesmo para uma cobertura mais abrangente do genoma ^4, pode ser possível usar muito menos do que a de 1000 mg de um material de base que nós recomendado acima.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water