Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Summary

Det cellulära heterogenitet av hjärnvävnad utgör en betydande begränsning för studier av epigenetiska märkningar i kromatin eftersom de flesta analyser saknar enda cell upplösning. Nervceller vanligtvis samsas med Glia och andra icke-neuronala celler. Vi erbjuder ett protokoll för att hämta och samla neuronala kärnor från mänskliga hjärnan.

Abstract

Nervceller i den mänskliga hjärnan blir postmitotic till stor del under prenatal utveckling och därmed bibehålla sin kärnor genom hela livslängd. Dock är lite känt om förändringar i neuronala kromatin och kärnkraft organisation under utveckling och åldrande, eller kronisk neuropsykiatriska sjukdomar. Men hittills mest kromatin och DNA baserade analyser (andra än fiskar) saknar en enda cell upplösning. I detta syfte ställer stora cellulära heterogena hjärnvävnaden en betydande begränsning, eftersom det vanligtvis olika subpopulationer av nervceller samsas med olika typer av Glia och andra icke-neuronala celler. En möjlig lösning skulle vara att växa celltyp specifika kulturer, men de flesta CNS-celler, även neuroner, är ex vivo hållbara, i bästa fall endast ett par veckor och därmed skulle ge en ofullständig modell för epigenetiska mekanismer kan vara verksamma över hela livslängden . Här ger vi ett protokoll för att extrahera och rena kärnor från fryst (aldrig fast) mänskliga döden hjärnan. Metoden innebär extraktion av kärnor i hypoton lyseringsbuffert, följt av ultracentrifugering och immunotagging med anti-Neun antikropp. Märkta neuronala kärnor sedan samlas in separat med hjälp av fluorescens-aktiverade sortering. Denna metod bör tillämpas på alla hjärnan region i ett brett spektrum av arter och lämpar sig för kromatin immunoprecipitation studier med plats-och ombyggnad specifika anti-histon antikroppar, samt för DNA-metylering och andra analyser.

Protocol

Nuclei Extraktion

1. Sätt 250 mg frysta obduktion hjärnvävnad i 5 ml lyseringsbuffert ¹ i en douncer och placera den på is. För att ta emot ca 5 miljoner kärnor efter FACS sortering, använder vi oftast 1000 mg av vävnad per prov.
2. När vävnad har tinat, dounce vävnaden i 1 minut medan på is.
3. Ta det homogeniserade vävnad och placera den i en 15 ml klar ultracentrifugen rör. Sätt röret på is.
4. Ta 9 mL sackaroslösning ² med en pipett, placera pipett i botten av den tydliga ultracentrifugen röret, och släpp sackaroslösning ² för att skapa en koncentrationsgradient med homogeniserade vävnaden lösningen på toppen av sackaroslösning ^2.
5. Väg ultracentrifugen rören för att se till att de alla kommer att vara i balans vid rotation inom ultracentrifugen. Gör eventuella justeringar i vikt genom att lägga lyseringsbuffert ¹ till det översta lagret.
6. Efter att rören har vägts, placera dem i rotorns hinkar.
7. Placera alla hinkar i en SW28 rotor och försiktigt placera rotorn in i ultracentrifugen.
8. Ultracentrifugen proverna på 107163,6 RCF i 2,5 timmar vid 4 ° C.
9. När centrifugeringen är klar, avlägsna supernatanten, tillsammans med det lager av skräp finns på koncentrationsgradienten med hjälp av vakuum, medan du är försiktig att inte störa pelleten innehåller kärnor i botten av röret.
10. Tillsätt 500 mikroliter 1X PBS till varje pellet och låt sitta på isen i 20 minuter. Detta gör att pelleten att lösa upp lite på egen hand, vilket gör det lättare att senare mekaniskt lösa det genom att pipettera upp och ned, vilket minskar mängden stress kärnorna erfarenhet.
11. När kärnorna har inkuberas på is i 20 minuter, mekaniskt pipett upp och ner för att helt upplösa kärnor inom 1XPBS.
12. Ta bort kärnorna innehåller lösningen ur ultracentrifugen rören och kombinera innehållet i två tuber till en enda 2 mL mikrocentrifugrör. Återigen, placera proverna på is.

Immunfärgning för FACS

1. I det här läget, göra en immunfärgning blandning bestående av primära och sekundära antikroppar och blockera Mix. För varje prov, kombinera 300 mikroliter av 1XPBS innehåller 1,2 mikroliter av Neun antikropp, 100 mikroliter att blockera Mix, som innehåller 0,5% BSA och 10% Normal Goat Serum i 1XPBS och 1 mikroliter av Alexa Fluor 488. För kontrollprover utesluta den primära antikroppen Neun och istället bara lägga till fler 1XPBS.
2. Vortexa immunfärgning blandningen och inkubera 5 minuter vid rumstemperatur i mörker.
3. Medan färgning blandningen ruvar, gör kontroller för proven. För FACS sortering, ett prov som innehåller kärnor ensam, som kallas "ofärgade kontroll" behövs, ett andra prov, en negativ kontroll, som innehåller kärnor med den sekundära antikroppen Alexa Fluor 488 utan att den primära antikroppen Neun också behövs.
4. Alikvotera 20 mikroliter av kärnorna innehåller lösningen i en 2 ml mikrocentrifugrör innehåller 1XPBS för ofärgade kontroll, och ytterligare 20 mikroliter till en annan 2 ml tub innehåller 980 ul 1XPBS för negativ kontroll. Höj volymen på atomkärnor som innehåller prov tillbaka upp till 1 ml med 1XPBS. Alla prover är tillbaka på isen.
5. Nu när immunfärgning blandningen är klar inkubation, lägg till dess innehåll av 401 mikroliter i motsvarande prover. Kärnan prov kommer att få blandning som innehåller både Neun och Alexa Fluor 488, medan negativt prov kommer att få blandning som innehåller endast den sekundära antikroppen Alexa Fluor 488.
6. Ta prover i kylrummet för att rotera i mörker i 45 minuter.
7. Efter att proverna har inkuberas i mörker i 45 minuter, lägg dem på is och föra dem till FACS facilitet. Under transport till FACS facilitet bör proverna förvaras på is och i mörker.

FACS

1. Vid FACS facilitet, filtrera proverna genom ett 40 um filter. Kör dem genom instrumentet i några minuter, samtidigt som förvaras kallt, för att få lite preliminära uppgifter före sortering.
2. Vid denna punkt, är det nödvändigt att ange lämplig portar som behövs för sortering. Flera olika portar används för att sortera prover. Den första porten ger en bild av storleken på de olika kärnor finns i provet, och tillåter separatation av skräp från faktiska kärnor. Den andra porten ger oss möjlighet att sortera kärnor individuellt. Kassera aggregat kasseras till denna punkt. Slutligen är den tredje porten inställd på en specifik fluorescens våglängd, matcha den i fluorokrom finns i våra sekundär antikropp. Placering denna port ger oss möjlighet att sortera och separera Neun +, alltså neuronala kärnor från Neun - kärnor.
3. När alla portar väljs, kan kärnan ska sorteras in i 1XPBS.
4. NärHela provet har gått igenom, kontrollera renhet sortera genom att köra en delmängd av det sorterade provet genom instrumentet. Se till att provets fluorescens inte sprids ut, utan snarare i en enda kvadrant. Det är bäst att välja prover som är över 90% ren.

Efter FACS

1. När provet har sorterats, kan påbörja bearbetning av kärnor. Ta 10 ml av sorterat provet och tillsätt 2 mL sackaroslösning ^2, 50 ul 1 M CaCl ₂ och 30 ul av 1m Mg (Ace) _2. Som en påminnelse, alltid se till att hålla provet på is eftersom kärnorna är ofixerade.
2. Om det är mindre än 10 mL sorterade prov, höja volymen upp till 10 ml genom att lägga 1XPBS, eller justera ytterligare material om detta.
3. Vänd prov flera gånger och placera på is i 15 minuter.
4. Efter att proverna inkuberades på is i 15 minuter, centrifugera dem i en gunga hink rotorn vid 1786 RCF i 15 minuter vid ⁴ ° C.
5. Kassera supernatanten med hjälp av ett vakuum, utan att störa den vita pellets finns längst ner i röret.
6. Lös pelleten i 200 ìl oavsett vilken lösning du behöver för förfarandet experiment, och pipettera upp och ner.
7. Överför lösningen i ett mindre rör och placera den i -80 ° C frys tills vidare användning.

Discussion

Protokollet presenteras här bör vara särskilt användbart för studier fokuserade på epigenetiska förändringar av neuronala kromatin och mer allmänt, om den molekylära fenotyp av den neuronala kärnan, under normal utveckling och åldrande, eller i neurologisk eller psykiatrisk sjukdom. Metoden är särskilt fördel när cellulära heterogenitet hjärnvävnad, inklusive eventuella förändringar i neuron till Glia ranson under åldrande eller på grund av sjukdom är ett bekymmer ^1. Till exempel genom att kombinera de nuvarande sortering protokoll med kromatin immunoprecipitation tekniker, beskrev vi nyligen neuron-specifik histon metyleringsmönster på hjärnan neurotrofa faktor (BDNF) genen, och för ytterligare neuronala gener ^2. En liknande metod har tidigare använts för att samla in nervceller från vuxna hjärnbarken för retrospektiv födseln datering ^3. Den sortering var också anställd i mus hjärnan ^2, och på grund av stabiliteten i atomkärnor i frysta-därefter-tinade vävnad, räknar vi med att den metod som presenteras här är tillämplig på ett brett spektrum av arter. Eftersom kromatin immunoprecipitation från så lite som 10.000 celler för nu är möjligt även för en mer omfattande genomet täckning ^4, kan det vara möjligt att använda mycket mindre än 1000 mg av utgångsmaterial som vi rekommenderar ovan.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water