Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Summary

De cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking voor de studie van de epigenetische markeringen in chromatine, omdat de meeste assays gebrek aan enkele cel resolutie. Neuronen meestal vermengd met glia en andere niet-neuronale cellen. Wij bieden een protocol te halen en neuronale kernen verzamelen van menselijke hersenen.

Abstract

Neuronen in de menselijke hersenen grotendeels worden postmitotische tijdens de prenatale ontwikkeling, en dus behouden hun kernen gedurende de volledige levensduur. Er is echter weinig bekend over veranderingen in neuronale chromatine-en nucleaire organisatie in de loop van de ontwikkeling en veroudering, of bij chronische neuropsychiatrische aandoeningen. Echter, de meeste chromatine en DNA-gebaseerde testen (anders dan die van vissen), gebrek aan enkele cel resolutie datum. Te dien einde, de aanzienlijke cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking, want meestal verschillende subpopulaties van neuronen worden vermengd met verschillende soorten glia en andere niet-neuronale cellen. Een mogelijke oplossing zou zijn om cel-type specifieke culturen groeien, maar de meeste CNS cellen, met inbegrip neuronen, zijn ex vivo een duurzame, op zijn best, maar een paar weken en zou dus een incompleet model voor epigenetische mechanismen mogelijk actief over de gehele levensduur te bieden . Hier bieden we een protocol te halen en kernen te zuiveren van bevroren (nooit vast) menselijke postmortem hersenen. De methode omvat extractie van kernen in hypotone lysis buffer, gevolgd door ultracentrifugatie en immunotagging met anti-Neun antilichaam. Gelabeld neuronale kernen worden vervolgens gescheiden ingezameld met behulp van fluorescentie-geactiveerde sorteren. Deze methode moet worden van toepassing op alle gebied van de hersenen in een breed scala van soorten en geschikt voor chromatine immunoprecipitatie studies met site-en modificatie-specifieke anti-histon antilichamen, en voor DNA-methylering en andere testen.

Protocol

Kernen Extraction

1. Doe 250 mg van bevroren postmortaal hersenweefsel in 5 ml Lysis Buffer ¹ in een douncer en plaats deze op ijs. Voor het ontvangen van ongeveer 5 miljoen kernen na FACS-sortering, we meestal gebruik van 1000 mg van de weefsels per monster.
2. Zodra het weefsel is ontdooid, dounce het weefsel voor een minuut, terwijl op ijs.
3. Neem de gehomogeniseerd weefsel en plaats deze in een 15 ml helder ultracentrifuge buis. Zet de tube op het ijs.
4. Neem 9 mL van Sucrose Oplossing ² met een pipet, zet de pipet op de bodem van de heldere ultracentrifuge buis, en laat de Sucrose Oplossing ² tot een concentratie verloop met de gehomogeniseerde tissue oplossing op de top van de Sucrose Oplossing ² te creëren.
5. Weeg de ultracentrifuge buizen om te zorgen dat ze allemaal zullen worden afgewogen tijdens het draaien binnen de ultracentrifuge. Maak eventuele aanpassingen van het gewicht door het toevoegen van Lysis Buffer ¹ tot en met de bovenste laag.
6. Nadat de buizen zijn gewogen, plaats ze in emmers van de rotor.
7. Plaats alle emmers in een SW28 rotor en zorgvuldig de rotor plaatsen in de ultracentrifuge.
8. Ultracentrifuge de monsters op 107.163,6 RCF gedurende 2,5 uur bij 4 ° C.
9. Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u het supernatant, samen met de laag van puin gevonden op de concentratie gradiënt, met het gebruik van een vacuüm, maar zorg ervoor dat u de pellet met de kernen op de bodem van de buis te verstoren.
10. Voeg 500 ul van 1X PBS aan elk pellet en laat zitten op ijs gedurende 20 minuten. Hierdoor kan de pellets om een ​​beetje te ontbinden op zijn eigen, waardoor het makkelijker wordt om later mechanisch te ontbinden door en neer te pipetteren, die vermindert de hoeveelheid stress de kernen ervaring.
11. Nadat de kernen hebben geïncubeerd op ijs gedurende 20 minuten, mechanisch pipet op en neer om volledig op te lossen de kernen binnen de 1XPBS.
12. Verwijder de kernen bevattende oplossing uit de ultracentrifuge buizen en combineren de inhoud van twee buizen in een 2 ml microcentrifugebuis. Nogmaals, plaats de monsters op het ijs.

Immunokleuring voor FACS

1. Op dit punt, maakt een immunokleuring mengsel van primaire en secundaire antilichaam en blokkeren Mix. Voor elk monster, combineer 300 ul van 1XPBS met 1,2 pi van Neun antilichaam, 100 ul van het blokkeren Mix, die 0,5% BSA en 10% normaal Geit Serum in 1XPBS, en een pi van Alexa Fluor 488 bevat. Voor de controle monsters, uitsluiten van het primaire antilichaam Neun en in plaats daarvan, voeg gewoon meer 1XPBS.
2. Vortex de immunokleuring mengsel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
3. Terwijl de kleuring mengsel is incuberen, maken de controles voor de monsters. Voor FACS sorteren, een monster met kernen alleen, genaamd de "ongekleurde control" nodig is; een tweede monster, een negatieve controle, met de kernen met het secundaire antilichaam Alexa Fluor 488, zonder het primaire antilichaam Neun is ook nodig.
4. Aliquot 20 pi van de kernen bevattende oplossing in een 2 ml microcentrifugebuis met 1XPBS voor de ongekleurd controle, en nog eens 20 il in de andere 2 ml buisje met 980 uL van 1XPBS voor de negatieve controle. Verhoog het volume van de kernen bevattende sample een back-up tot 1 ml met 1XPBS. Alle monsters zijn terug geplaatst op het ijs.
5. Nu de immunokleuring mengsel klaar is met incubatie, voeg de inhoud van 401 pi in de juiste monsters. De kernen monster krijgt het mengsel die zowel Neun en Alexa Fluor 488, terwijl de negatieve monster van het mengsel met alleen het secundaire antilichaam Alexa Fluor 488 te ontvangen.
6. Neem de monsters in de koude kamer in het donker te draaien voor 45 minuten.
7. Nadat de monsters geïncubeerd in het donker gedurende 45 minuten, zet ze op ijs en breng ze naar de FACS faciliteit. Tijdens het transport naar de FACS faciliteit, moeten de monsters worden bewaard op ijs en in het donker.

FACS

1. Op de FACS-faciliteit, filter de monsters door een 40 um filter. Vervolgens lopen ze door het instrument voor een paar minuten, terwijl ze bleef koud, om een ​​aantal voorlopige gegevens vóór sortering te krijgen.
2. Op dit punt, is het noodzakelijk om de juiste poorten die nodig zijn voor het sorteren. Er zijn verschillende poorten worden gebruikt om te sorteren monsters. De eerste poort geeft een idee van de omvang van de verschillende kernen te vinden in de steekproef, en maakt het mogelijk separatation van puin van de werkelijke kernen. De tweede poort stelt ons in staat om individueel sorteren kernen. Gooi alle aggregaten worden verwijderd op dit punt. Ten slotte wordt de derde poort instellen op een specifieke fluorescentie golflengte, die overeenkomt met die van de fluorochroom vinden in onze secundaire antilichaam. Het plaatsen van deze poort stelt ons in staat om te sorteren en scheiden Neun +, dus neuronale kernen van Neun - kernen.
3. Nadat alle poorten zijn gekozen, kunnen de kernen worden gesorteerd in 1XPBS.
4. Zodra dehele steekproef heeft doorgemaakt, controleer dan de zuiverheid van de soort door het uitvoeren van een hoeveelheid van de gesorteerde monster door het instrument. Zorg ervoor dat het monster fluorescentie niet is verspreid, maar is opgenomen in een kwadrant. Het is het beste om te kiezen monsters, die meer dan 90% zuiver.

Na FACS

1. Nadat het monster is gesorteerd, kan beginnen met de verwerking van de kernen. Neem 10 ml van het monster en gesorteerd aan toe te voegen 2 ml van Sucrose Oplossing ^2, 50 uL van 1M CaCl ₂ en 30 ul van 1m Mg (Ace) _2. Ter herinnering, altijd zeker om het monster te houden op het ijs, omdat de kernen zijn niet vastgelegde.
2. Als er minder dan 10 ml van de gesorteerde monster, verhogen van het volume tot 10 ml door het toevoegen van 1XPBS, of dienovereenkomstig aan te passen de extra materialen.
3. Omkeren van het monster een paar keer en plaats op ijs gedurende 15 minuten.
4. Nadat de monsters geïncubeerd op ijs gedurende 15 minuten, centrifugeer ze in een emmer swing rotor in 1786 RCF gedurende 15 minuten bij ⁴ ° C.
5. Verwijder het supernatant met het gebruik van een vacuüm, zonder verstoring van de witte pellet gevonden op de bodem van de buis.
6. Los de pellet in 200 ui van welke oplossing u nodig heeft voor de procedure experimenten, en pipet op en neer.
7. Breng de oplossing in een kleinere buis en plaats deze in de -80 ° C vriezer tot verder gebruik.

Discussion

Het protocol hier gepresenteerde moeten in het bijzonder nuttig zijn voor onderzoek gericht zijn op epigenetische veranderingen van neuronale chromatine en, meer algemeen, over de moleculaire fenotype van de neuronale kern, tijdens de normale ontwikkeling en veroudering, of in de neurologische of psychiatrische ziekte. De methode is vooral van voordeel bij de cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel, inclusief mogelijke verschuivingen in neuron-to-glia rantsoen in de loop van het ouder worden of door ziekte zijn een punt van ^{zorg: 1.} Bijvoorbeeld door het combineren van de huidige sorteer-protocol met chromatine immunoprecipitatie technieken, hebben we onlangs neuron-specifieke histon methylatie patronen beschreven op de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) gen promoter, en voor aanvullende neuronale genen ^2. Een vergelijkbare methode werd eerder gebruikt om neuronen te verzamelen van volwassen cerebrale cortex voor retrospectieve geboorte uit ^3. Het sorteren techniek werd ook gebruikt in de hersenen van muizen ^2, en vanwege de stabiliteit van de kernen in de diepvries-then-ontdooid weefsel, verwachten we dat de hier gepresenteerde benadering is toepasbaar op een breed scala aan soorten. Omdat de chromatine immunoprecipitatie al vanaf 10.000 cellen voor is nu haalbaar, zelfs voor een uitgebreidere dekking genoom ^4, kan het mogelijk zijn om veel minder dan de 1000 mg van het starten van materiaal dat we boven de aanbevolen gebruik.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water