Summary
Il modello di ratto post-natale per ipossico-ischemica lesioni cerebrali è un consolidato modello di umano neonatale encefalopatia ipossico ischemica (HIE). In questo articolo, si descrive il modello di HIE in post-natale cuccioli di ratto.
Abstract
Encefalopatia ipossico-ischemica (HIE) è la conseguenza di asfissia sistemica che si verificano al momento della nascita. Venticinque per cento dei neonati con HIE sviluppare gravi e permanenti conseguenze neuropsicologiche, compreso il ritardo mentale, paralisi cerebrale ed epilessia. Gli esiti di HIE sono devastanti e permanenti, il che rende fondamentale per identificare e sviluppare strategie terapeutiche per ridurre le lesioni cerebrali nei neonati con HIE. A tal fine, il modello di ratto neonatale per ipossico-ischemica danno cerebrale è stato sviluppato per questo modello condizione umana. Il modello HIE è stato convalidato da Vannucci et al 1 e da allora è stato ampiamente usato per identificare i meccanismi di danno cerebrale perinatale risultante da ipossia-ischemia 2 e per testare potenziali interventi terapeutici 3,4. Il modello HIE è un processo in due fasi e prevede la legatura della carotide comune sinistra seguita da esposizione a un ambiente ipossico. Flusso ematico cerebrale (CBF) nell'emisfero ipsilaterale alla legatura dell'arteria carotide non diminuisce a causa del flusso collaterale sangue attraverso il circolo di Willis, ma con la tensione di ossigeno inferiore, la CBF nell'emisfero ipsilaterale diminuisce significativamente e si traduce in unilaterali danno ischemico . L'uso di 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per colorare ed identificare tessuto ischemico cerebrale è stato originariamente sviluppato per i modelli adulti di ischemia cerebrale roditori 5, e viene utilizzato per valutare il grado di infarctin cerebrale in momenti primi fino a 72 ore dopo l'evento ischemico 6. In questo video, dimostriamo la ipossico-ischemica modello lesioni nel cervello di ratto post-natale e la valutazione della dimensione dell'infarto mediante colorazione TTC.
Protocol
Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University e si attiene alle linee guida dell'Istituto Nazionale di Sanità per l'uso di animali da esperimento.
Neonatale Rat modello HIE
- Giorni post-parto (PND) 7 Sprague-Dawley ratti (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) sono completamente anestetizzati con isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL; 3-4% per l'induzione e 1-2% per manutenzione).
- Una piccola incisione viene fatta nel collo (Extra Sottile Forbici Iris # 14088-10, Fine Science Strumenti Inc, Foster City, CA) per esporre la sinistra arteria carotide comune (CCA).
- Il CCA è legatura con una sutura di seta 5-0 (5-0 seta, Ethicon, Somer, NJ).
- L'incisione viene chiusa con adesivo cianoacrilato (Elmers Products Inc, Columbus, OH). L'incisione è coperta di nastro e l'anestesia è fermato. I cuccioli sono tornati alle loro diga e ha permesso di recuperare per 1-2 ore.
- I cuccioli vengono poi poste in una camera ipossica che contiene l'8% di ossigeno equilibrato con il 92% di azoto per 100 minuti a 37 ° C. 8% di azoto dei gas oxygen/92% (Airgas, Sacramento, CA) che attraverso un tubo nella gabbia del mouse dotato di un coperchio di plastica. La copertina è fatta per adattarsi alla gabbia e ha due fori di 2 cm di diametro, una delle quali per ricevere il tubo collegato alla bombola di ossigeno 8% del gas e un altro permette al gas di flowout. La camera si trova in un bagno d'acqua ed è riscaldato prima dell'uso e un termometro all'interno di esso deve registrare 37 ° C prima di ipossia.
- Alla fine di 100 minuti di ipossia, i cuccioli sono tornato di nuovo ai loro diga per il recupero.
- 24 ore dopo la fine di ipossia, i cuccioli sono eutanasia da anestesia profonda con isoflurano. Tessuto cerebrale è perfuso con soluzione fisiologica fredda, seguita da una soluzione di fredda 1% TTC in tampone fosfato, pH 7.4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). TTC devono essere tenuti al riparo dalla luce.
- Cervelli sono stati rimossi e raffreddati per 1-2 minuti in ghiaccio, e quattro sezioni coronali 3 mm tra i (livelli 1-4) vengono tagliati, a partire rostralmente a livello del opticchiasm e infundibolo, corrispondente al bregma 1,8 ~ 2,0 mm Livello di il cervello di topo adulto.
- Sezioni di cervello sono immersi in una TTC e incubate a 37 ° C per 8 minuti, seguita da fissazione in paraformaldeide 4% / PBS durante la notte. TTC perché è sensibile alla luce, tenere le fette al riparo dalla luce durante questo periodo.
- Le sezioni colorate TTC vengono scansionati e digitalizzati. Utilizzando immagini J (NIH, Bethesda, MD), i seguenti sono misurati per ogni livello: area di infarto (area senza macchia), l'area dell'emisfero ipsilaterale, e la zona dell'emisfero controlaterale. La percentuale dell'area infartuata per fetta è calcolato come: (area di infarto / area di emisfero ipsilaterale), A 1, A 2, A 3 e A 4. Il volume percentuale di infarto è calcolato come la somma (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3 mm. Aree di lesioni corticali o striato può anche essere quantificato separatamente in modo simile.
Rappresentante Risultati
Figura 1. Rappresentante HIE livelli coronale 1-4 macchiata di TTC.
TTC sezioni colorate coronali dimostrare area di infarto (in bianco).
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Discussion
Il modello di roditore postnatale HIE è un modello stabilito che l'ipossia cerebrale ricapitola che si verificano nel periodo peri-natale dei neonati. Ampi studi istologici e caratterizzazione immunocitochimica hanno dimostrato che il roditore 7 giorni vecchio ha la maturità analogo cervello per modellare terzo trimestre di gravidanza 7 feto umano. Il modello di HIE roditore è stato molto istruttivo per comprendere i meccanismi di danno cerebrale perinatale da ipossia 2, dove interventi come l'ipotermia sono stati convalidati 3. Questo modello è stato inizialmente perfezionato nei ratti e più recentemente adattato ai topi 8.
Ci sono dettagli tecnici specifici che meritano di essere:
- Prima di legatura del CCA, assicurarsi di rimuovere il tessuto connettivo e nervo vago che possono impigliare CCA. Con legatura di successo del CCA, il colore nave al di sopra del sito legatura dovrebbe diventare bianco. In alternativa, si raccomanda inoltre di raddoppiare legare e tagliare a metà di due sito legatura. Coprire l'incisione sulla legatura CCA con del nastro prima di inserire l'etichetta sul retro cucciolo con la sua diga.
- Una durata massima di non più di 10 minuti di anestesia per ogni cucciolo è ottimale per la legatura CCA e successo.
- Il periodo di recupero dopo la legatura CCA dovrebbe essere 90-120 minuti. Se più brevi, i cuccioli hanno meno probabilità di sopravvivere, e se più ci sarà una maggiore variabilità di infarto, tendente più piccoli infarti.
- La temperatura è critica. Sempre posto un termometro nella camera e mantenere la temperatura a 37 ° C. La lunghezza di ipossia può variare da 90 ai 120 minuti a seconda della situazione e la gravità delle lesioni si desidera raggiungere.
- Colorazione TTC è applicabile per l'analisi del volume dell'infarto fino a 72 ore dopo la HIE. Più punti del tempo di sopravvivenza devono essere valutati dal sezionamento e colorazione violetto cresolo per determinare la dimensione dell'infarto.
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Acknowledgments
Finanziato dalla American Heart Association e March of Dimes.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
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