Summary
hypoxic - 허혈성 뇌 손상에 대한 출생 후의 쥐 모델은 인간의 신생아 hypoxic 허혈성 뇌증 (히에)의 잘 설립 모델입니다. 이 문서에서는, 우리는 포스트 나탈 쥐 새끼의 히에의 모델을 설명합니다.
Abstract
Hypoxic - 허혈성 뇌증 (히에)는 출생시 질식 발생 체계의 결과이다. 히에과 neonates의 25 %는 정신 지체, 뇌성 마비 및 간질을 포함하여 심각한 및 영구 neuropsychological sequelae을 개발합니다. 히에의 결과는 히에와 신생아의 뇌 손상을 줄이기 위해 치료 전략을 파악하고 개발하는 것이 중요하고, 파괴 및 영구 있습니다. 이를 위해, hypoxic - 허혈성 뇌 손상에 대한 신생아 쥐 모델이 인간의 조건을 모델로 개발되었습니다. 히에 모델 처음 Vannucci 외 1 확인되었으며 이후 광범위하게 perinatal hypoxia - 국소 빈혈이로 인한 뇌 손상의 메커니즘을 파악하고 잠재적인 치료 중재에게 3,4를 테스트하는 데 사용되었습니다. 히에 모델은 두 단계 프로세스입니다 hypoxic 환경에 노출 다음 왼쪽 일반적인 경동맥의 결합을 포함한다. 출혈도 잡았 경동맥에 ipsilateral 반구의 대뇌 혈류 (CBF)이 있기 때문에 윌리스의 원을 통해 부수적인 혈류의 감소하지 않고 있지만 낮은 산소 긴장과 ipsilateral 북반구에서 CBF가 크게 감소하고 일방적 허혈성 부상 결과 . 허혈성 뇌 조직을 얼룩 및 식별 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC)의 사용은 원래 쥐 대뇌 국소 빈혈 5 성인 모델 개발되었고, 최대 72 초기 시간 지점에서 뇌성 infarctin의 범위를 평가하는 데 사용됩니다 허혈성 이벤트 6 시간 이후. 이 비디오에서는, 우리는 출생 후의 쥐 두뇌에있는 hypoxic - 허혈성 손상 모델 및 TTC의 얼룩을 사용하여 경색 크기의 평가를 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 실험 동물의 사용을위한 건강 지침 국립 연구소에 의해 스탠포드 대학 abides에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
신생아 랫 히에 모델
- 3-4 유도에 대한 %와 1-2 %; 포스트 나탈 일 (쿨러) 7 스프 라그 - 돌리 랫 새끼가 (찰스 리버 연구소, 주식 회사, 윌밍턴, MA) (Aerrane, 백스터, 디어 필드, IL isoflurane과 완벽하게 anesthetized 아르 유지 보수).
- 작은 절개는 왼쪽 일반적인 경동맥의 동맥 (CCA)를 노출 (엑스트라 씬 아이리스 가위 # 14088-10, 좋은 과학 도구 병원, 포스터 시티, CA)를 목에 이루어집니다.
- CCA는 5-0 실크 봉합사 (5-0 실크, Ethicon, 소머, 뉴저지)과 출혈도 잡았입니다.
- 절개는 cyanoacrylate 접착제 (엘머스 제품 병원, 콜럼버스, OH)으로 닫힙니다. 절개는 테이프로 덮여 있으며, 마취가 중지됩니다. 새끼들은 댐에 반환하고 1-2시간에 대한 회복하다 수 있습니다.
- 펍스 그러면 37 100 분 92% 질소와 균형을 8 % 산소를 포함하는 hypoxic 챔버 ° C.에 배치됩니다 8퍼센트 oxygen/92 %의 질소 가스 (Airgas, 새크라멘토, CA) 플라스틱 커버와 복 마우스 케이지에 튜브를 통해 흐름. 커버가 케이지에 맞게 만들어 직경 2cm의 구멍을 가지고있다 한 8 %의 산소 가스 탱크 및 다른 연결된 튜브를받을 수있는 중 가스 flowout 수 있습니다. 챔버는 물을 욕조에 배치되고 사용하기 전에 예열하고 그 내부에 온도계가 hypoxia의 시작하기 전에 37 ° C를 등록해야합니다.
- hypoxia의 백분의 끝에, 새끼가 복구를 위해 자신의 댐을 다시 반환됩니다.
- 24시간 hypoxia의 끝 후에 새끼는 isoflurane과 깊은 마취에 의해 euthanized 있습니다. 뇌 조직은 염분, pH를 7.4 (시그마 화학 CO, 세인트 루이스, MO) 버퍼 인산의 추위 1퍼센트 TTC의 해결책 다음, 차가운 정상적인 생리와 perfused 있습니다. TTC는 빛과 보호 보관해야합니다.
- 두뇌가 제거하고 얼음에 1-2분, 4 코로나 섹션 간격 3mm (레벨 1-4)를 냉각하는 것은 bregma 1.8에 해당하는 opticchiasm과 infundibulum 수준에서 rostrally 시작 버렸어요의 ~ 2.0 mm 수준 성인 마우스 뇌.
- 뇌 조각이 TTC 용액에 열중하고 4 % paraformaldehyde / PBS 하룻밤에 고정 다음, 8 분 ° C 37 incubated 수 있습니다. TTC는 빛을 구분하므로,이 시간 동안 빛으로부터 조각 거리 유지.
- TTC 자국이 섹션은 스캔과 디지털됩니다. 경색 면적 (흠없는 지역), ipsilateral 북반구의 영역, 그리고 contralateral 북반구의 면적 : 이미지 J (NIH, 베데스다, MD), 다음은 각 수준에 대한 측정을 사용합니다. 1, 2, 3, 4 (경색 / ipsilateral 반구의 영역의 면적) 또는 : %는 슬라이스마다 지역으로 계산됩니다 infarcted. 경색의 퍼센트 볼륨의 합계 (A 1 + 2 + 3 + 4) * 3mm로 계산됩니다. 피질 또는 striatal 부상 분야도 별도로 비슷한 방식으로 계량하실 수 있습니다.
대표 결과
그림 1. TTC와 함께 대표 히에 코로나 레벨 1-4 얼룩.
TTC 스테인드 코로나 섹션 경색의 영역 (흰색)을 보여줍니다.
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Discussion
설치류 출생 후의 히에 모델 recapitulates 대뇌 hypoxia은 신생아에서 페리 - 산후 기간 동안 발생하는 설치 모델입니다. 광범위한 histological 및 immunocytochemical 특성화 연구 칠일 오래된 설치류은 세번째 임신 인간 태아의 7 모델 유사한 뇌의 성숙을 갖고 증명하고있다. 쥐 히에 모델은 저체온증과 같은 개입은 3 확인되었습니다 페리 - 나탈 hypoxia 2의 뇌 손상의 메커니즘을 이해하기위한 매우 유익한되었습니다. 이 모델은 처음에는 쥐에 완벽하게 그리고 더 최근의 생쥐 8 맞게되었다.
언급을 보증 구체적인 기술적인 세부 사항이 있습니다 :
- CCA의 결합하기 전에, 결합 조직 및 CCA를 빠뜨리다 수 있습니다 미주 nervus을 제거하십시오. CCA의 성공적인 결합을 통해 결합 사이트 위의 선박 색상은 흰색으로 바뀝니다해야합니다. 또는, 그것은 또한 ligate 이중 두 내고 사이트의 중간에 절단하는 것이 좋습니다. 그 댐으로 강아지를 다시 삽입하기 전에 라벨 테이프로 출혈도 잡았 CCA를 통해 절개를 커버.
- 각각의 강아지에 대한 마취하지 10 분 이상의 최대 기간은 CCA의 내고 성공적인 결과를 위해 최적입니다.
- CCA의 결합 후 회복 기간은 90~1백20분해야합니다. 짧은 경우, 새끼가 생존 확률이 적은있어 준다면 더 이상 작은 infarcts쪽으로 돌봐주, 경색의 많은 다양성이있을 것이다.
- 온도가 중요합니다. 항상 챔버에 온도계를 놓고 37 온도를 유지 ° C. hypoxia의 길이는 90에서 달성하려는 부상의 상황과 심각에 따라 120분에 따라 다를 수 있습니다.
- TTC의 얼룩 최대 히에 후 72시간에 경색 볼륨의 분석에 적용됩니다. 긴 생존 시간이 지점은 경색 크기를 결정하는 sectioning 및 cresyl 보라색 얼룩에 의해 평가해야합니다.
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Acknowledgments
미국 심장 협회와 천 년 3 월에 의해 자금 지원.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
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