Summary
低酸素性虚血性脳損傷のための出生後のラットのモデルは、ヒト新生児低酸素性虚血性脳症（HIE）の十分に確立されたモデルです。この記事では、出生後の仔ラットのHIEのモデルについて説明します。
Abstract
低酸素性虚血性脳症（HIE）は、出生時に発生する全身性仮死の結果です。 HIEによる新生児の二五％は精神遅滞、脳性麻痺、てんかんを含め、厳しいと永続的な神経心理学的後遺症を開発する。 HIEの成果は、それが重要なHIEで新生児の脳損傷を軽減する治療戦略を特定し、開発すること、壊滅的と永続的です。そのために、低酸素性虚血性脳損傷のための新生児ラットモデルは、この人間の状態をモデル化するために開発されました。 HIEモデルは、最初バヌチら1によって検証され、以来広く周産期低酸素虚血2から生じる脳損傷のメカニズムを識別し、潜在的な治療介入の3,4をテストするために使用されています。 HIEモデルでは、2段階のプロセスであり、低酸素環境への曝露に続いて左総頸動脈の結紮を伴います。連結された頸動脈に同側半球の脳血流量（CBF）は、理由ウィリス動脈輪を介して側副血流量の減少しませんが低い酸素分圧で、同側半球のCBFは有意に減少し、一方的な虚血性傷害の結果。虚血脳組織を染色して識別するために、2,3,5 -塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）の使用は、元来はげっ歯類の脳虚血5の成人モデルのために開発され、最大72までの早期の時点で脳infarctinの程度を評価するために使用されます虚血性イベント6時間後。このビデオでは、我々は生後ラット脳における低酸素性虚血性損傷モデル、TTC染色を用いて梗塞サイズの評価を示しています。
Protocol
このプロトコルは、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所によってスタンフォード大学と遵守に動物実験用の委員会により承認された。
ラット新生HIEモデル
- 3から4誘導のための％とは1-2％、産後の日（PND）7のSprague - Dawleyの仔ラットは、（チャールズリバー研究所、（株）、ウィルミントン、MA）（Aerrane、バクスター、ディアフィールド、イリノイ州イソフルランで完全に麻酔するメンテナンス）。
- 小切開は、左総頸動脈（CCA）を公開する（エクストラシンアイリスはさみ＃14088から10、ファイン科学ツール株式会社、フォスターシティ、カリフォルニア州）の首に行われます。
- CCAは、5から0絹縫合糸（5-0絹、エチコン、ゾマー、NJ）と連結する。
- 切開は、シアノアクリレート系接着剤（エルマーズプロダクツ株式会社、コロンバス、オハイオ州）で閉じられます。切開は、テープで覆われていると麻酔が停止されます。子犬は、そのダムに戻り、1〜2時間のために静養に許可されています。
- 子犬は、その後37℃で100分間、92％の窒素℃でバランス8％の酸素が含まれている低酸素室に置かれている8パーセントoxygen/92％の窒素ガス（Airgasの、サクラメント、カリフォルニア州）プラスチックカバーを装備したマウスのケージにチューブを経由して流れ。カバーがケージに合うように作られ、直径2cmの2つの穴を持っている、1つの8％の酸素ガスのタンクと別に接続されたチューブを受け取るためにそのうちにガスがflowoutすることができます。チャンバーは、水浴に配置され、使用前にウォームアップしていて、その内部に温度計は、低酸素の開始前に37℃を登録する必要があります。
- 低酸素の100分の終わりに、子犬は回復のための彼らのダムに再び戻されます。
- 24時間低酸素状態の終了後、仔はイソフルランと深い麻酔により安楽死されています。脳組織は、生理食塩水、pH7.4（シグマケミカル共同、セントルイス、MO）リン酸緩衝の冷たい1パーセントTTCのソリューションに続く、冷生理食塩水で灌流される。 TTCは、光から保護しておく必要があります。
- 脳を除去し、冷却した氷上で1〜2分、4つの冠状セクション離れて3ミリメートル（レベル1-4）のためにブレグマ1.8〜に対応する、opticchiasmと漏斗のレベルで吻方始め、カットされています〜2.0 mmのレベルを成体マウスの脳。
- 脳スライスをTTC溶液に浸漬し、4％パラホルムアルデヒド/ PBSで一晩固定に続いて、8分間37℃でインキュベートする。 TTCは光に敏感なので、この時間の間に光からスライスを遠ざけること。
- TTC染色した切片はスキャンおよびデジタル化されています。使用してイメージJ（NIH、ベセスダ、MD）、以下はレベルごとに測定されています：梗塞の領域（未染色領域）、同側半球の面積、および対側半球の面積を。スライスごとのパーセント梗塞部位は次のように計算されます（同側半球の梗塞/地域の面積）または1、2、3、4。梗塞のパーセントの容積は、合計として計算される（A 1 + A 2 + A 3 + A 4）* 3ミリメートル。皮質や線条体損傷の領域も別々に同様の方法で定量することができる。
代表的な結果
図1。 TTCと代表的なHIE冠状レベル1-4で染色。
TTC染色した冠状セクションでは、梗塞の領域（白）を示しています。
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Discussion
げっ歯類生後HIEモデルでは、反復する脳低酸素症は新生児の周囲出生期間に発生したことが確立されたモデルです。大規模な組織学的および免疫組織化学的特性の研究は、7日齢齧歯類は妊娠後期ヒトの胎児7をモデル化するために類似した脳の成熟度を持っていることを実証している。げっ歯類のHIEモデルでは、低体温などの介入が3を検証している周囲の出生低酸素症2、から脳損傷のメカニズムを理解するにあたって非常に有益されています。このモデルは、最初にラットに完成し、最近ではマウスの8に適合させた。
言及を保証する特定の技術的な詳細があります。
- CCAのライゲーションの前に、結合組織およびCCAを紛糾可能性迷走神経を必ず削除してください。 CCAの成功ライゲーションして、ライゲーション部位上記の容器の色が白くなります。また、それはまた、ライゲーションダブル二ライゲーション部位の途中で切断することをお勧めします。そのダムで子犬バックを配置する前にラベルをテープで連結されたCCA以上の切開をカバーしています。
- それぞれ子犬のための麻酔のない10分以上の最大持続時間は、CCAのライゲーション、良好な結果に最適です。
- CCAのライゲーション後の回復期間は90〜120分にしてください。短い場合、子犬は生き残る可能性は低い、とより長い場合は、小さい梗塞に向かって傾向、心筋梗塞のより多くのばらつきがあるでしょう。
- 温度は重要です。常にチャンバー内の温度計を配置し、37℃で温度を維持℃に低酸素の長さは90から達成したい負傷の状況と重大度に応じて120分に異なる場合があります。
- TTC染色では、最大HIE後72時間まで梗塞体積の解析に適用可能です。より長い生存期間の点は梗塞サイズを決定するために切片とクレシルバイオレット染色によって評価されるべきである。
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Acknowledgments
アメリカ心臓協会とダイムの月によって資金を供給。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
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