Summary
Это протокол, описывающий, как изолировать и культуры первичных симпатических нейронов из верхних шейных ганглиев (SCG) новорожденных крысят.
Abstract
Верхних шейных ганглиев (SCG) у крыс, мелкие, блестящие, миндалевидные структуры, которые содержат симпатические нейроны. Эти нейроны симпатической иннервации обеспечить для головы и шеи регионов и они представляют собой хорошо известных и относительно однородным населением (4). Симпатические нейроны зависят от фактора роста нервов (ФРН) за выживание, дифференцировку и рост аксонов и распространенный наличие NGF облегчает их культуре и экспериментальные манипуляции (2, 3, 6). По этим причинам, культурный симпатических нейронов были использованы в самых разнообразных исследований, включая нейронные развития и дифференцировки, механизмы запрограммированной и патологической гибели клеток и передачи сигнала (1, 2, 5 и 6). Пройдя из ГКО от новорожденных крыс и культивирования симпатических нейронов не очень сложна и может быть освоен достаточно быстро. В этой статье мы расскажем в деталях, как рассекают из ГКО от новорожденных крысят и использовать их для создания культурах симпатических нейронов. Статья будет также рассказано о подготовительных шагов и различных реагентов и оборудования, которые необходимы для достижения этой цели.
Protocol
1. Подготовка для вскрытия:
- Выберите подходящее блюдо культуры (10 см или 6-и или 24-луночных планшетах и т.д.) в зависимости от характера вашего экспериментов, и покрыть их крысы хвост коллагена за 24 часа до вскрытия. Методы получения крысы хвост коллагена и использовать его для блюд пальто культуры были описаны в другом месте (1).
- Подготовка 0,25% раствора трипсина в фосфатном буферном растворе (PBS) (без ЭДТА) и фильтр стерилизуют. Подготовка 1 мл аликвоты и хранить при -20 º C.
- Подготовка раствора, содержащего 2,5 мМ каждого из уридина и 5-FDU в дистиллированной / деионизированной H 2 O. Фильтр-стерилизовать и подготовить 50 мкл аликвоты. Хранить при -20 ° С.
- Подготовить всю среда: RPMI 1640 культуральной среде с 10% тепла инактивированной лошадиной сыворотки (тепловой инактивации путем инкубации в 56 ° С водяной бане в течение 30 минут) и 5% эмбриональной телячьей сыворотки.
- Подготовка заключительного среда: RPMI 1640 культуральной среде с 1% тепла инактивированной лошадиной сыворотки + NGF (100ηg/ml конечная концентрация) + пенициллина / стрептомицина (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU решения (10 мкМ конечная концентрация) . Обратите внимание: эта среда должна быть составлена свежие Перед использованием каждый раз. Для эксперимента в 24-луночный планшет формата, один будет необходимо подготовить 12 мл этой среды. Мы рекомендуем вам подготовиться немного больше. NGF можно приобрести у различных коммерческих источников (см. таблицу в конце этого протокола).
- Оборудование: Один будет необходимость вскрытия микроскопа и источника света. Двойная гусиная шея волоконно-оптический осветитель с фокусировкой советов является предпочтительным. Кроме того, один будет необходимо для очистки и стерилизации (в автоклаве или замачивания в 70% этилового спирта не менее 20 минут) следующие инструменты вскрытия: две пары микро-рассечение нержавеющей стали пинцет и пара рассечение ножницами (в том числе из нержавеющей стали и как с Roboz). Две стерильные иглы шприца (26 gague х 1 ½ дюйма или аналогичный) также будет необходимо. Необходимо создать рассечение борту, который 3 "x3" кусок пенопласта, завернутые в алюминиевую фольгу и покрыты Kimwipe. Спрей плату с 70% этанолом для обеззараживания. Наконец, подготовить огневой полировкой пипеткой пастбищами стекла. В целях пожарной польский, возьмите стеклянную пипетку и удерживать наконечник в пламени в течение нескольких секунд, при вращении. После осмотра, кончик будет выглядеть более гладкой и открытия будет уже. Это необходимо для того этапа, когда клетки будут диссоциированы. Выполните пожарной полировки капота культуре клеток, так что остается стерильной пипеткой.
2. Препарирование верхних шейных ганглиев:
- Сбор новорожденных крысят, которые имеют возраст P0 или P1.
- Быстро протрите щенка для вскрытия с 70% этанола, чтобы уменьшить шансы заражения.
- Быстро обезглавить щенок с острой ножницы (этот шаг не будет показано в видео). Держите головки с помощью стерильного пинцета против стерильной марли, чтобы кратко стока избыточной крови.
- Место голову на вскрытии пластины с вентральной стороной вверх и хвостового конца ориентированы на вас. Разорвала трахеи должна быть хорошо видна. Используйте стерильные иглы шприца для обеспечения отрубленной головы до вскрытия площадки следующим образом: нажмите один вывод, хотя небо в блокнот и нажмите второй контактный хотя разорвали трахею в площадку. Место подкладку под микроскопом рассекает и начать вскрытие.
- Используя оба щипцы (по одному в каждой руке), убрать кожу и жир вокруг трахеи, заботясь, чтобы не зайти слишком глубоко. Делать это выставит пару мышц работает почти параллельно друг другу по обе стороны трахеи. Примечание: во время вскрытия, то вам нужно орошать холодной стерильной PBS или холода, бессывороточной RPMI 1640, поставляются с стерильный, пипетки Пастера, чтобы смыть избыток крови и держать в чистоте и влажным. Это может быть сделано только один раз или несколько раз в зависимости от того, насколько быстро работает один. Для опыта прозектором, он занимает всего около двух-трех минут, чтобы вскрыть из пары ганглиев.
- Используйте пинцет, чтобы сократить и удалить мышц на одной стороне первого.
- Как только мышцы удаляется, сонной артерии становятся видимыми. Часто это легкий розоватый и содержит крови. Может показаться, светлее, чем в других кровеносных сосудов, которые вы можете увидеть в окрестностях и по этой причине сонной артерии не могут быть заметны сразу же. Это артерия проходит вдоль трахеи и разветвляется в то, что выглядит как "Y"-образные ленты. Такое раздвоение является важной вехой и как только она находится, то это будет относительно легко найти ГКО.
- Север артерии на самом хвостового конца и поднимите его немного с пинцетом (другого конца еще прилагается). Как только вы это сделаете, вы увидите, миндалевидные, блестящие глядя небольшая масса ткани, которая косвенное отношение к артерии только в точке бифуркации и которое ЧетEAD, как пред-и / или после ганглиозные связок. Это верхнего шейного ганглия. Используйте вторую пару щипцов, с другой стороны, чтобы аккуратно снимите его и поместить в небольшое блюдо культуры (35 мм), содержащий холодно, без сыворотки RPMI 1640.
- Затем экстракт ганглия на другую сторону трахеи следующий же протокол.
3. Очистка Ganglia:
- После того как все узлы были расчлененные, они должны быть освобождены как можно больше посторонних тканей.
- Под микроскопом рассечение, вы можете видеть, что ганглии придают куски сонной артерии, жира или других тканей. Работа с пинцетом в каждой руке, чтобы дразнить от этих нежелательных материалов. Место очищается ганглиев в стерильные 15 мл конические, полипропиленовые трубы, содержащей RPMI 1640.
- Пред-и / или после ганглиозные связок должны быть урезаны прочь. Каждый ганглий имеет около 10000 нейронов. Как только нейроны покрыты, то они будут вырастить их невриты.
4. Создание Симпатическая культуры Нейрон:
- Центрифуга ганглиев в 200xg в течение 2 минут и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют ганглиев в 0,5 к 1 мл 0,25% раствора трипсина. Место в 37 ˚ C водяную баню или инкубатор на 30 минут. Это поможет отделить клетки в ганглиях.
- Через 30 минут, добавить 10 мл полной среды разбавить и нейтрализовать трипсина и центрифуге при 200xg течение 2 минут.
- Удалите супернатант и ресуспендируют в 2 мл Заключительные Средний.
- Далее диссоциируют клетки путем растирания ганглиев вверх и вниз с огневой полировкой пипеткой пастбищами стекла. Измельченного в порошок ганглиев в 20 раз и поместить трубку на льду в течение нескольких минут.
- Между тем, пожаро-польский пипетки другое, чтобы сделать открытие узком (около 2 / 3 до 1 / 2 мм в диаметре). Подождите несколько минут, пока она остывает и растирают ганглиев 20 раз больше. Как вы продолжите, среда будет становиться все размытым о том, что клетки диссоциируемого. Повторите этот шаг несколько раз больше, в зависимости от того, как клетки диссоциируют. Через некоторое время вы заметите, что все узлы имеют диссоциированных в нейроны и не нетронутыми ганглии видны в трубу. Там могут быть некоторые ткани материал, который не диссоциируют. На данный момент, не говоря трубки сидеть в лед в течение нескольких минут, так что любой мусор может недиссоциированных оседают на дно. Теперь аккуратно собирают почти все среды от верхней и место в другой трубке. Чтобы убедиться, что вы не собирают недиссоциированных мусора, оставляют около 50 мкл в нижней части трубы. Добавить еще Заключительного среду в пробирку диссоциированных клеток: этот объем зависит от типа одной культуры пластины используются в культуру нейронов. Например: если 24-а блюдо должно быть занято, то пластины 0,5 ганглиев на скважину (~ 10 000 нейронов на лунку) в 0,5 мл Заключительные среду на лунку. Типичный помет крысы состоит из 12 щенков, которые дали бы 24 узлов. Этого достаточно, чтобы семя один 24-луночного планшета и общий объем Заключительные среды 12 мл. Примечание: ганглиев также содержат небольшое население глии и другие типы клеток, которые будут присутствовать в культуре. Использование Uridine/5-FDU в Заключительном среда будет предотвратить его распространение и содействие их смерти.
- Поток клетки каждые 48 часов по замене 2 / 3 от среды с свежим RPMI +1% лошадиной сыворотки + NGF и uridine/5-FDU. Примечание: Во-первых, культура содержит симпатические нейроны, осмотреться, не невриты. Короткие нейритов становятся видимыми через 24 часа после вскрытия и постепенно становятся более плотными и более разветвленные с течением времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы используем Sprague Dawley крыс для нашей культуры.
Найдите время и ухода при чистке ганглиев. Удалите все обломки, кровеносных сосудов и жира. Этот шаг важен в обеспечении культуры, которая более или менее однородное и свободным от посторонних типов клеток. Добавление uridine/5-FDU будет в значительной степени устранить любые остающиеся без нейронов (митотический) клетки загрязняющих культуры или хотя бы подавить их распространения.
Кроме того, при диссоциации шаг, будьте терпеливы и не торопитесь, чтобы отдельные нейроны так, чтобы они не встречаются в больших скоплений, как только они высевают на пластины. Наличие большого скопления клеток не даст хороших результатов эксперимента. Например, большие скопления затруднит для нейронов для трансфекции или инфицирована. Иммуноокрашивание также может быть затруднено и любые эксперименты, которые требуют подсчета нейронов будет трудно выполнить, а также.
Нет необходимости в дополнение к среде с пером / стрептококк каждый раз, когда культура кормили. Добавление ручка / стрептококк самый первый раз, клетки высевают достаточно. Как добавить свежий uridine/5-FDU к среде, каждый раз, когда среда обмена.
Мы использовали симпатических нейронов культуры для изучения апоптоза в ответ на NGF-вывода. Например, в Бисвас и соавт. 2007 (2), отзывчивый нейроны трансфицированных shRNA против нескольких молекул, которые играют важную роль в развитии апоптоза. Deckwerth и соавт. 1996 (5) использовали симпатические нейроны от дикого типа мышей и мышей, лишенных проапоптическую гена Bax. Они посмотрели на то, как эти нейроны ведут себя, когда они лишены NGF. Рисунок 6 из Бисвас и соавт. 2007 (2) и на рисунке 3 из Deckwerth и соавт. 1996 (5) показывают, что трансфекции и не трансфицированных симпатических нейронов культур выглядеть соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NZ хотел бы поблагодарить членов лаборатории Субхаса Бисвас, Эндрю Спроул, и Райан Виллет для обучения ее вскрытии и уборки симпатических нейронов. Поддержке грантов от NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
