Summary
هذا هو بروتوكول تصف كيفية عزل الخلايا العصبية والثقافة متعاطفة الأساسي من العقد العنقية العليا (SCG) من الفئران الوليدة الوليد.
Abstract
في العقد متفوقة عنق الرحم (SCG) في الفئران ، لامعة صغيرة ، لوزية الشكل الهياكل التي تحتوي على الخلايا العصبية المتعاطفة. هذه الخلايا العصبية توفير innervations متعاطفة عن الرأس والعنق والمناطق التي يشكل عدد سكانها جيدا ، وتتميز متجانسة نسبيا (4). الخلايا العصبية المتعاطفة تعتمد على عامل نمو الاعصاب (نيسان الخليج) لتحقيق النمو والبقاء التمايز والمحاور وانتشرت على نطاق وتوافر NGF يسهل ثقافتهم والتلاعب التجريبية (2 ، 3 ، 6). لهذه الأسباب ، فقد تم استخدام الخلايا العصبية المتعاطفة مثقف في طائفة واسعة من الدراسات بما في ذلك تطوير الخلايا العصبية والتفرقة ، وآليات للموت الخلايا المبرمج والمرضية ، ونقل الإشارة (1 ، 2 ، 5 ، و 6). تشريح خارج SCG من الفئران حديثي الولادة وزراعة الخلايا العصبية المتعاطفة ليست معقدة للغاية ويمكن أن تتقن بسرعة إلى حد ما. في هذه المقالة ، فإننا سوف تصف بالتفصيل كيفية تشريح خارج SCG من الفئران الوليدة الوليد واستخدامها لإنشاء الثقافات من الخلايا العصبية المتعاطفة. وتصف المقالة أيضا الخطوات التحضيرية والكواشف والمعدات المختلفة التي يحتاجها لتحقيق ذلك.
Protocol
1. التحضير للتشريح :
- حدد طبق الثقافة المناسبة (10 سم أو 6 لوحات جيدا أو جيدا 24 ، الخ.) تبعا لطبيعة من التجارب الخاصة بك ، ومعطف لهم ذيل فأر 24 ساعة قبل تشريح الكولاجين. وقد وصفت وسائل لاعداد الجرذان ذيل الكولاجين واستخدامها لأطباق معطف الثقافة في مكان آخر (1).
- يعد حل التربسين 0.25 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (بدون EDTA) وفلتر تعقيم. 1 مل aliquots إعداد وتخزين -20 درجة مئوية في C.
- تحضير محلول يحتوي على 2.5 ملي كل من يوريدين و 5 في FDU المقطر / منزوع الأيونات H 2 O. فلتر تعقيم وتجهيز 50 aliquots ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية.
- إعداد متوسطة أكمل : RPMI مستنبت 1640 مع المعطل للحرارة بنسبة 10 ٪ مصل الحصان (الحرارة التي يحتضنها تعطيل في بالحمام المائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) ، و 5 ٪ مصل بقري جنيني.
- إعداد متوسطة النهائي : RPMI مستنبت 1640 مع الحرارة المعطل 1 ٪ الحصان المصل + NGF (100ηg/ml التركيز النهائي) + البنسلين / الستربتوميسين (1 / 250) + حل uridine/5-FDU 1 / 250 (10 ميكرومتر تركيز النهائي) . ملاحظة : ينبغي بذل هذه الوسيلة الجديدة حتى قبل استخدامها في كل مرة. عن تجربة في شكل لوحة 24 جيدا ، وسوف يحتاج المرء لإعداد 12 مل من هذا المتوسط. فمن المستحسن أن تقوم بإعداد قليلا اضافية. يمكن شراؤها NGF من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية (انظر الجدول في نهاية هذا البروتوكول).
- المعدات : واحد سوف تحتاج إلى مجهر تشريح ومصدر الضوء. ويفضل من الألياف البصرية معقوفة منار المزدوجة مع نصائح التركيز. بالإضافة إلى ذلك ، سوف يحتاج المرء لتنظيف وتعقيم (عن طريق التعقيم أو تمرغ في الايثانول 70 ٪ على الأقل 20 دقيقة) وأدوات تشريح التالية : زوجين من الدقيقة تشريح ملقط الفولاذ المقاوم للصدأ ، وزوج من مقص تشريح (أيضا الفولاذ المقاوم للصدأ وكلاهما من Roboz). وسيتم أيضا اثنين من إبر المحاقن المعقمة (26 × 1 gague ½ بوصة أو ما شابه) تكون هناك حاجة. فمن الضروري لاقامة مجلس تشريح ، وهو 3 "X3" قطعة من الستايروفوم ملفوفة بورق الألمنيوم ومغطاة Kimwipe. رذاذ متنها الإيثانول 70 ٪ لتطهير. أخيرا ، تعد لإطلاق النار الزجاج المصقول المراعي ماصة. من أجل تلميع إطلاق النار ، واتخاذ ماصة الزجاج وعقد قمة في لهب لبضع ثوان ، في حين تناوب. عند التفتيش ، وسوف تبدو أكثر سلاسة غيض وفتح ستكون أضيق. هذه هي خطوة ضرورية لخلايا حيث سيتم فصلها. أداء النار تلميع في خلية غطاء الثقافة بحيث يبقى ماصة معقمة.
2. تشريح العقد العنقية العليا :
- جمع الجراء الفئران حديثي الولادة التي هي في سن أو P0 P1.
- يمسح بسرعة الجرو لتشريح الايثانول مع 70 ٪ لتقليل فرص التلوث.
- قطع رأس الجرو بسرعة مع زوج من مقص حاد (لن تكون هذه الخطوة تظهر في شريط الفيديو). عقد رئيس باستخدام ملقط معقم ضد شاش معقم لاستنزاف الدم لفترة وجيزة الزائدة.
- وضع رأسه على الوسادة تشريح مع الجانب البطني مواجهة ونهاية الذيل موجهة نحوك. يجب قطع القصبة الهوائية تكون مرئية بسهولة. استخدام إبر المحاقن المعقمة لتأمين رأس مقطوع لوحة تشريح على النحو التالي : دفع one دبوس على الرغم من أن سقف الفم في لوحة ودفع دبوس الثاني رغم قطع القصبة الهوائية في لوحة. وضع وسادة تحت المجهر تشريح والبدء تشريح.
- باستخدام كل ملقط (واحدة في كل يد) الجلد واضحة بعيدا والدهون حول القصبة الهوائية ، مع الحرص على عدم ذهاب عميقا جدا. وسوف نفعل ذلك يعرض زوج من العضلات مواز تقريبا لبعضها البعض على جانبي القصبة الهوائية. ملاحظة : أثناء تشريح ، سوف تحتاج إلى ري مع برنامج تلفزيوني العقيمة الباردة أو باردة ، 1640 مصل مجانا RPMI المتوسطة تسليمها مع ماصة معقمة باستور ، ليغسل الدم الزائد وإبقاء المنطقة نظيفة ورطبة. ويمكن القيام بذلك إلا مرة واحدة أو أكثر من مرة تبعا لمدى سرعة واحد يعمل. لمشرح الخبرة ، فإنه يأخذ فقط حوالي 2-3 دقائق لتشريح من زوج من العقد.
- استخدام ملقط لقطع وإزالة العضلات على جانب واحد أولا.
- بمجرد إزالة العضلات ، والشريان السباتي تصبح مرئية. غالبا ما يكون وردي خفيف ويحتوي على الدم. قد يبدو أفتح لونا من الأوعية الدموية الأخرى التي قد ترى في محيط ، ولهذا السبب الشريان السباتي قد لا يكون ملحوظا على الفور. هذا الشريان يعمل جنبا إلى جنب مع القصبة الهوائية وbifurcates الى ما يشبه "Y" على شكل شريط. هذا التشعب يشكل معلما هاما ويقع مرة واحدة ، فإنه سيكون من السهل نسبيا العثور على SCG.
- قطع الشريان في نهاية معظم الذيلية ورفعه ارتفاعا طفيفا مع ملقط (لا يزال مربوطا الطرف الآخر). بمجرد القيام بذلك ، سوف تشاهد لوزية الشكل ، لامعة كتلة صغيرة من الأنسجة التي تبحث هي فضفاضة يعلق على الشريان فقط في نقطة والتشعب الذي عبتيEAD مثل قبل و- / أو آخر ، connectives العقدية. هذه هي العقدة متفوقة عنق الرحم. استخدام ملقط من الزوج الثاني في اليد الأخرى لفصل برفق ومكان في صحن الثقافة الصغيرة (35 مم) التي تحتوي على والمصل الباردة مجانا RPMI 1640 المتوسط.
- المقبل ، استخراج عقدة على الجانب الآخر من القصبة الهوائية بعد بروتوكول نفسه.
3. تنظيف العقد :
- مرة واحدة وقد تم تشريح كل من العقد ، ينبغي الافراج عنهم قدر المستطاع من الأنسجة دخيلة.
- تشريح تحت المجهر ، قد ترى أن العقد قد تعلق قطعة من الشريان السباتي ، والأنسجة الدهنية أو غيرها. العمل مع ملقط في كل يد لندف بعيدا هذه المواد غير المرغوب فيها. تنظيف مكان العقد الى المخروطية 15ml العقيمة ، أنبوب البولي بروبيلين ، وتحتوي على 1640 RPMI المتوسط.
- وينبغي أيضا connectives قبل و / أو العقدية آخر ، يتم قطع بعيدا. كل عقدة لديها نحو 10000 الخلايا العصبية. حالما يتم مطلي الخلايا العصبية ، فإنها تنمو neurites بهم.
4. تأسيس ثقافة متعاطف الخلية العصبية :
- أجهزة الطرد المركزي في العقد في 200xg لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف.
- Resuspend على العقد في 0،5-1 مل من محلول التربسين 0.25 ٪. مكان بالحمام المائي في 37 ˚ C أو حاضنة لمدة 30 دقيقة. وهذا سيساعد على فصل الخلايا في العقد.
- بعد 30 دقيقة ، وإضافة 10 مل من متوسطة إلى كاملة لتخفيف وتحييد التربسين والطرد المركزي في 200xg لمدة 2 دقيقة.
- تجاهل وطاف resuspend في 2 مل من متوسطة النهائي.
- فصل الخلايا عن طريق زيادة الطحن في العقد صعودا وهبوطا مع اطلاق النار من الزجاج المصقول ماصة المراعي. يسحن في العقد 20 مرة ، ووضع أنبوب على الجليد لبضع دقائق.
- وفي الوقت نفسه ، النار تلميع أكثر ماصة لجعل فتح أضيق (حوالي 2 / 3 إلى 1 / 2 مليمتر في القطر). انتظر بضع دقائق حتى يبرد ويسحن في العقد 20 مرة أكثر من ذلك. كما قمت بالمتابعة ، سوف تصبح تدريجيا المتوسطة مشيرا إلى أن الخلايا cloudier يتم فصلها. كرر هذه الخطوة مرة أو مرتين أكثر اعتمادا على مدى فصل الخلايا. بعد بعض الوقت ، ستلاحظ أن جميع العقد قد نأت الى الخلايا العصبية والعقد ليس سليما واضحة في الأنبوب. قد يكون هناك بعض المواد الأنسجة التي لن تنفصل. عند هذه النقطة ، والسماح للأنبوب الجلوس في الثلج لبضع دقائق حتى أن أي تسوية يمكن أن الحطام undissociated إلى أسفل. الآن بعناية جمع ما يقرب من جميع المتوسط من أعلى مكان ، وآخر في الأنبوب. لضمان أن لا جمع الحطام undissociated ، وترك نحو 50 ميكرولتر في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة أكثر من المتوسط النهائي للأنبوب التي تحتوي على الخلايا تنفصل : هذا الحجم يعتمد على نوع من ثقافة واحدة لوحة يستخدم للثقافة الخلايا العصبية. على سبيل المثال : إذا طبق بشكل جيد هو 24 لاستخدامها ، ثم لوحة العقد 0،5 لكل بئر (~ 10000 الخلايا العصبية لكل بئر) في 0.5 مل من المتوسط النهائي لكل بئر. أ القمامه الفئران نموذجية تتكون من 12 الجراء ، والتي ستعطي العقد 24. هذا هو ما يكفي لوحة البذور 24 واحد وكذلك إجمالي حجم متوسط النهائي هو 12 مل. ملاحظة : في العقد تحتوي أيضا على عدد صغير من السكان من أنواع الخلايا الدبقية ، والأخرى التي ستكون حاضرة في الثقافة. وسوف تستخدم في المتوسط Uridine/5-FDU النهائي منع انتشارها وتعزيز وفاتهما.
- تغذية الخلايا كل 48 ساعة عن طريق استبدال 2 / 3 من وسيلة جديدة مع RPMI +1 ٪ الحصان NGF + المصل وuridine/5-FDU. ملاحظة : في البداية ، وثقافة يحتوي على الخلايا العصبية التي تبدو متعاطفة مع عدم وجود جولة neurites. neurites قصيرة تصبح مرئية بعد 24 ساعة من تشريح وتصبح تدريجيا أكثر كثافة وأكثر بمرور الوقت تشعبت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نستخدم سبراغ داولي الفئران لثقافاتنا.
يستغرق وقتا طويلا والحذر عند تنظيف العقد. إزالة جميع السفن الحطام في الدم ، والدهون. هذه الخطوة هامة في ضمان وجود الثقافة التي هي أكثر أو أقل متجانسة وخالية من أنواع الخلايا الدخيلة. وإضافة إلى حد كبير uridine/5-FDU القضاء على أية خلايا العصبية المتبقية غير (الإنقسامية) تلويث الثقافة أو على الأقل منع انتشارها.
بالإضافة إلى ذلك ، خلال الخطوة تفارق ، التحلي بالصبر وتأخذ من الوقت للفصل بين الخلايا العصبية بحيث لا يتم العثور عليها في كتل كبيرة حالما يتم بذرها على لوحات. وجود كتل كبيرة من الخلايا لا تسفر عن نتائج تجريبية جيدة. على سبيل المثال ، فإن كتل كبيرة تجعل من الصعب على أن الخلايا العصبية transfected أو المصابة. ويمكن أيضا أن تعوق Immunostaining وأي التجارب التي تتطلب عد الخلايا العصبية سيكون من الصعب تنفيذها ، كذلك.
ليس من الضروري لاستكمال المتوسطة مع القلم / بكتيريا في كل مرة تتم تغذية الثقافات. بالإضافة إلى ذلك الوقت من ركلة جزاء / بكتيريا الأولى هي مطلي الخلايا غير كافية. لا تضيف جديدا لuridine/5-FDU المتوسط في كل مرة يتم فيها تبادل المتوسط.
لقد اعتدنا ثقافة العصبية متعاطفة مع دراسة الخلايا استجابة لانسحاب - NGF. على سبيل المثال ، في بيسواس آخرون. 2007 (2) ، كانت متعاطفة مع الخلايا العصبية transfected shRNA عدة ضد الجزيئات التي تلعب دورا هاما في تعزيز موت الخلايا المبرمج. Deckwerth وآخرون. واستخدمت 1996 (5) الخلايا العصبية المتعاطفة من الفئران والجرذان wildtype تفتقر الى الجين الموالية لأفكارك ، باكس. لقد نظروا في كيفية التصرف عند هذه الخلايا العصبية يتم حرمانهم من نيسان الخليج. الشكل 6 من بيسواس وآخرون. 2007 (2) والشكل (3) من Deckwerth وآخرون. 1996 (5) واظهار ما transfected غير transfected الثقافات العصبية تبدو متعاطفة ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ونيوزيلندي أود أن أشكر أعضاء مختبر سوبهاس بيسواس ، سبرول أندرو ، ويليت ريان على تدريبها في تشريح وحصاد الخلايا العصبية المتعاطفة. بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
