Summary
Detta är ett protokoll som beskriver hur man isolera och odla primära sympatiska nervceller från överlägsen livmoderhalscancer ganglierna (SCG) för nyfödda råttungar.
Abstract
Den överlägsna livmoderhalscancer ganglierna (SCG) hos råttor är små, glänsande, mandelformade strukturer som innehåller sympatiska nervceller. Dessa nervceller ger sympatiska innervations för huvudet och hals och de utgör en väldefinierad och relativt homogen befolkning (4). Sympatiska nervceller är beroende av nervtillväxtfaktor (NGF) för överlevnad, differentiering och axonal tillväxt och den utbredda tillgängligheten av NGF underlättar deras kultur och experimentell manipulation (2, 3, 6). Av dessa skäl har odlade sympatiska nervceller använts i en mängd olika studier med nervsystemets utveckling och differentiering, mekanismer för programmerad och patologiska celldöd och signal transduktion (1, 2, 5 och 6). Dissekera ut SCG från nyfödda råttor och odling sympatiska nervceller inte är mycket komplicerat och kan bemästras ganska snabbt. I denna artikel kommer vi att beskriva i detalj hur man dissekera ut SCG från nyfödda råttungar och att använda dem för att upprätta kulturer av sympatiska nervceller. Artikeln kommer även att beskriva de förberedande åtgärder och de olika reagenser och utrustning som behövs för att uppnå detta.
Protocol
1. Förberedelse för dissekering:
- Välj lämplig kulturen skålen (10 cm eller 6-bra eller 24-brunnars plattor, osv) beroende på vilken typ av dina experiment, och päls dem med rått-svans kollagen 24 timmar före dissekering. Metoderna för att förbereda rat-tail kollagen och använda den till rätter pälsen kulturen har beskrivits på andra ställen (1).
- Bered en 0,25% Trypsin lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (inget EDTA) och filtrera sterilisera. Bered 1 ml alikvoter och förvara vid -20 º C.
- Bered en lösning som innehåller 2,5 mm vardera uridin och 5-FDU i destillerat / avjoniserat H 2 O. Filter-sterilisera och förbereda 50 l alikvoter. Förvara vid -20 º C.
- Förbered Komplett Medium: RPMI 1640 odlingsmedium med 10% värmeinaktiveras hästserum (värme inaktivera genom inkubering i ett 56 ° C vattenbad under 30 minuter) och 5% fetalt bovint serum.
- Förbered Final Medium: RPMI 1640 odlingsmedium med 1% värmeinaktiveras häst serum + NGF (100ηg/ml slutlig koncentration) + penicillin / streptomycin (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU lösning (10 mikroM slutlig koncentration) . Obs: detta medium bör bestå färska före användning varje gång. För ett experiment i en 24-brunnar format, kommer ett måste förbereda 12 ml av detta medium. Det rekommenderas att du förbereder lite extra. NGF kan köpas från en mängd olika kommersiella källor (se tabell i slutet av detta protokoll).
- Utrustning: Man kommer att behöva en dissekera mikroskop och ljuskälla. En dubbel svanhals fiberoptisk belysning med fokus tips är att föredra. Dessutom kommer ett behov av att rengöra och sterilisera (i autoklav eller blötläggning i 70% etanol i minst 20 minuter) följande dissektion verktyg: två par mikro-dissekera rostfri pincett, och ett par dissekera sax (även rostfritt stål och båda från Roboz). Två sterila kanyler (26 gague x 1 ½ inches eller liknande) kommer också att behövas. Det är nödvändigt att inrätta en dissektion styrelse, som är en 3 "x3" bit frigolit inlindad i aluminiumfolie och täcks med ett Kimwipe. Spraya brädan med 70% etanol att sanera. Slutligen, förbereda en brand-polerat pipett glas bete. För att brand-polska, ta glaspipett och håll spetsen i lågan under några sekunder, samtidigt som roterar. Vid inspektion, kommer spetsen ser mjukare och öppningen blir smalare. Detta är nödvändigt för det steg där cellerna ska skiljas. Utför brand-polering i en cellkultur huva så att pipetten är steril.
2. Dissekering av Superior livmoderhalscancer Ganglia:
- Samla neonatal råttungar som är av ålder P0 och P1.
- Snabbt torka valpen för dissektion med 70% etanol för att minska risken för smittspridning.
- Snabbt halshugga valp med en vass sax (detta steg kommer inte att visas i videon). Håll huvudet med hjälp av steril tång mot steril gasbinda att kortfattat dränera överflödigt blod.
- Placera huvudet på dissekering pad med den ventrala sidan uppåt och den bakre änden orienterade mot dig. De avskurna luftstrupen bör vara lätt synlig. Använd sterila kanyler för att säkra avhuggna huvudet till dissekera pad på följande sätt: tryck ett stift om gommen i dynan och tryck det andra stiftet om det avhuggna luftstrupen i plattan. Placera plattan under dissekera mikroskop och börja dissekering.
- Använd båda pincett (en i varje hand) rensa bort skinn och fett runt luftstrupen, se till att inte gå för djupt. Att göra detta kommer att utsätta ett par muskler som körs nästan parallellt med varandra på vardera sidan av luftstrupen. Obs: Under dissektion, måste du vattna med kallt sterilt PBS eller kall, serum gratis RPMI 1640 mediet levereras med en steril, pasteurpipett att tvätta bort överflödigt blod och för att hålla området rent och fuktigt. Detta kan bara göras en gång eller flera gånger beroende på hur snabbt man arbetar. För en upplevelse DISSEKTOR tar det bara cirka två till tre minuter att dissekera ut ett par ganglierna.
- Använd pincett för att skära och ta bort muskler på ena sidan först.
- När muskeln tas bort kommer halspulsådern blir synliga. Ofta är det lätt rosafärgad och innehåller blod. Det kan synas ljusare i färgen än andra blodkärl som du kan se i närheten och därför halspulsådern kanske inte märks direkt. Denna artär löper vid sidan av luftstrupen och bifurcates i vad som ser ut som ett "Y"-formade band. Denna tudelning är en viktig milstolpe och när den är placerad, kommer det vara relativt lätt att hitta SCG.
- Sever artären på den mest stjärt slutet och lyft upp det något med pincett (den andra änden sitter fortfarande). När du gör detta kommer du att se en mandelformade, glättat ser liten massa av vävnad som är löst knuten till artär precis på det ställe bifurkationen och som har thrEAD-liknande pre-och / eller postganglionära konnektiv. Detta är den överlägsna livmoderhalscancer ganglion. Använd en andra pincett i den andra handen för att försiktigt ta loss den och placera i en liten kultur fat (35 mm) med kallt, serum gratis RPMI 1640 medium.
- Nästa, extrahera ganglion på andra sidan av luftstrupe enligt samma protokoll.
3. Rengöring av Ganglia:
- När alla ganglierna har dissekeras ut, bör de frigöras så mycket som möjligt av främmande vävnad.
- Enligt dissektion mikroskop kan du se att ganglierna har bifogat bitar av halspulsådern, fett eller annan vävnad. Arbeta med tång i varje hand för att retas bort dessa oönskade material. Placera rengöras ganglier i en steril 15 ml konisk, polypropylen rör, som innehåller RPMI 1640 medium.
- Före och / eller postganglionära konnektiv bör också putsas bort. Varje ganglion har cirka 10.000 nervceller. När nervceller är pläterade, kommer de att återfå sitt neurites.
4. Etablera Sympatisk Neuron kultur:
- Centrifugera ganglierna vid 200xg i 2 minuter och kassera supernatanten.
- Resuspendera ganglierna hos 0,5 till 1 ml 0,25% trypsin lösning. Placera i ett 37 ˚ C vattenbad eller inkubator i 30 minuter. Detta kommer att hjälpa separera celler i ganglierna.
- Efter 30 minuter, tillsätt 10 ml Komplett Medium för att späda ut och neutralisera trypsin och centrifugera vid 200xg i 2 minuter.
- Kassera supernatanten och återsuspendera i 2 ml Final Medium.
- Ytterligare separera celler genom finfördelande den ganglierna upp och ner med elden-polerat glas bete pipett. Mal sönder ganglierna 20 gånger och placera röret på is i några minuter.
- Under tiden, brand-polska pipetten mer att göra öppningen smalare (cirka 2 / 3 till 1 / 2 mm i diameter). Vänta några minuter tills den svalnar och mal sönder ganglierna 20 gånger mer. Som du fortsätter kommer mediet blivit allt grumligare vilket tyder på att cellerna är dissocierade. Upprepa detta steg en eller två gånger mer beroende på hur väl de celler dissociera. Efter en tid kommer du att märka att alla ganglierna har dissocierade till nervceller och inget intakt ganglierna är synliga i röret. Det kan finnas vissa vävnader material som inte dissociera. Vid denna punkt, låt röret sitta i is i ett par minuter så att alla odissocierad skräp kan sjunka till botten. Nu försiktigt samla nästan alla av mediet från toppen och placera den i ett annat rör. För att säkerställa att du inte samlar odissocierad skräp, lämna ca 50 l vid botten av röret. Lägg till fler av Final medellång till röret med dissocierade celler: denna volym beror på vilken typ av kultur plattan man använder till kultur nervceller. Till exempel: om en 24-bra maträtt skall anställas, sedan plattan 0,5 ganglierna per brunn (~ 10 tusen neuroner per brunn) i 0,5 ml av Final medelstora per brunn. En typisk råtta kull består av 12 valpar, vilket skulle ge 24 ganglierna. Detta är tillräckligt för frö en 24-brunnar och den totala volymen av Final medium är 12 ml. Obs: ganglierna också innehålla en liten population av Glia och andra typer cell som kommer att finnas i kulturen. Använda Uridine/5-FDU i finalen mediet kommer att förhindra deras spridning och främja deras död.
- Feed celler var 48 timmar genom att byta ut 2 / 3 av mediet med färska RPMI 1% hästserum + NGF och uridine/5-FDU. Anm: Till en början innehåller den kultur sympatiska nervceller som ser runda utan neurites. Kort neurites blir synliga 24 timmar efter dissektion och successivt blivit tätare och mer förgrenad över tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi använder Sprague Dawley för våra kulturer.
Ta dig tid och omsorg vid rengöring av ganglierna. Ta bort allt skräp, blodkärl och fett. Detta steg är viktig för att se en kultur som är mer eller mindre homogen och fri från främmande celltyper. Tillskottet av uridine/5-FDU kommer till stor del eliminera återstående icke-neuronala (mitotiska) celler förorenar kultur eller åtminstone hämma deras spridning.
Dessutom, under dissociation steg, ha tålamod och ta dig tid att separera nervceller så att de inte finns i stora klumpar när de är seedade på tallrikar. Med stora klumpar av celler kommer inte att ge goda experimentella resultat. Till exempel kommer stora klumpar göra det svårt för de nervceller som ska transfekterade eller infekterade. Immunfärgning kan också hindras och de experiment som kräver att räkna nervceller kommer att bli svårt att genomföra, liksom.
Det är inte nödvändigt att komplettera mediet med penna / streptokocker varje gång kulturer har utfodrats. Tillägg av penna / streptokocker första gången cellerna är pläterade är tillräcklig. Lägger färska uridine/5-FDU för mediet varje gång mediet byts ut.
Vi har använt sympatiska neuronal kultur att studera apoptos som svar på NGF-uttag. Till exempel i Biswas et al. 2007 (2), var sympatisk nervceller transfererats med shRNA mot flera molekyler som spelar en viktig roll i främjandet av apoptos. Deckwerth et al. 1996 (5) har använt sympatisk nervceller från wildtype möss och möss som saknar den pro-apoptotiska genen, Bax. De har tittat på hur dessa nervceller beter sig när de är berövade NGF. Figur 6 från Biswas et al. 2007 (2) och Figur 3 från Deckwerth et al. 1996 (5) visar vad transfekterade och icke-transfekterade sympatiska neuronala kulturer ser ut, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NZ vill tacka labbet medlemmar Subhas Biswas, Andrew Sproul, och Ryan Willet för träning henne i dissekera och skörd sympatiska nervceller. Finansierats med bidrag från NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
