Drosophila ( Drosophila ) Dissection des glandes accessoires mâles : une méthode pour isoler les cellules secondaires

- Sous un microscope à dissection et dans des supports complétés par sérum, enlever l’appareil reproducteur de chaque mouche avec des forceps. Tout d’abord, enlever les parties du tube digestif qui peuvent avoir accompagné le tractus reproducteur. Isoler les glandes accessoires et le conduit éjaculatoire, retirer les testicules, l’ampoule éjaculatoire, et la terminalie. Laver le tissu pendant une à deux minutes dans PBS pour enlever le sérum. Puis, le transférer à la solution de dissociation.

Pour exposer les cellules à l’intérieur des glandes à la solution de dissociation, maintenez le centre de chaque glande avec des forceps et tranchez à travers la glande avec une paire de forceps pointus. Enlever la partie proximale de la glande et le conduit éjaculatoire pour laisser derrière lui l’extrémité distale des glandes contenant la population de cellules secondaires rares responsable de sécréter les protéines impliquées dans l’accouplement. Enfin, transférer les pointes de glande accessoire à un tube de micro centrifugeuse en préparation de la digestion. Dans le protocole suivant, nous disséquerons les glandes accessoires pour isoler les cellules secondaires pour l’analyse transcriptome.

- Avant de commencer la procédure, couper et faire feu rond, larges 200 conseils microlitres pour manipuler les glandes, et passer l’ouverture de pointe de plusieurs pointes de 1000 microlitres près d’une flamme pendant moins d’une seconde pour rétrécir les ouvertures. Puis, trier les pointes modifiées de plus étroite à plus large en fonction de leur vitesse d’aspiration. Pour la dissection accessoire des glandes, placer 20 à 25 drosophiles mâles dans un plat en verre sur la glace et utiliser des forceps et un microscope à dissection pour enlever l’appareil reproducteur d’une mouche mâle.

Effacer la paire de glandes accessoires de tous les autres tissus, y compris les testicules et l’ampoule éjaculatoire, et transférer les glandes accessoires dans une plaque de verre contenant du sérum complété moyen à température ambiante. Lorsque 20 paires de glandes accessoires ont été recueillies, lavez les glandes dans un plat de PBS pendant une à deux minutes à température ambiante. À la fin du lavage, transférez les glandes à une solution de dissociation fraîchement préparée et utilisez des forceps tranchants sous un microscope dissectant pour pincer fermement le milieu d’un lobe glandulaire.

À l’aide d’une deuxième paire de forceps, couper le tissu avec la pointe pointue pour séparer la région proximale de la glande accessoire et le conduit éjaculatoire de la partie de la glande contenant des cellules secondaires. Ensuite, utilisez une flamme pré-humide arrondie large pointe pipette de 200 microlitres pour transférer les glandes à un tube de 1,5 millilitre.