Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For enkelt orm PCR analyse, tillade en hermafrodit orm til selv at befrugte og lægge æg, der vil producere genetisk identiske afkom og derfor bevare en kopi af den modificerede stamme. Derefter overføre forældrene til et rør, der indeholder orm lysis buffer.
Frys røret ved minus 80 grader Celsius for at bryde neglebåndet eller det ydre lag op. Varm prøven til plus 60 grader Celsius for at lyse ormens celler, der frigiver de intracellulære proteiner sammen med cellens genomiske DNA. Ved denne temperatur nedbryder proteinase K i bufferen proteinerne, især kerner, der ellers ville ødelægge det genomiske DNA.
Derefter hæve temperaturen til 95 grader Celsius for at inaktivere enzymet. Endelig tilsættes cellelysatet til et rør med en PCR-masterblanding sammensat af reaktionsbuffer, dNTP'er, fremad- og omvendt primere for interesseområdet, taq polymerase og vand, der bringer reaktionen på et ønsket slutvolumen. For at udføre PCR skal du køre det relevante termiske cyklusprogram, der forstærker DNA-området af interesse.
I følgende eksempel vil vi se en PCR-procedure, der skal screenes for CRISPR-Cas9-redigeringshændelser i det genomiske DNA fra enkelte F1-orme.
- Efter 1 til 2 dages æglægning skal du bruge et ormbillede til at overføre F1'erne til individuelle PCR-striprørhætter, der indeholder 7 mikroliter varm lysisbuffer. Centrifuge PCR-rørene ved maksimal hastighed og stuetemperatur i et minut for at bringe dyrene til bunden af røret.
Dernæst lyse frosne orme i en termisk cycler ved hjælp af følgende program. Derefter skal du oprette en PCR master mix som vist i denne tabel.
Tilsæt derefter 21 mikroliter pcr master mix i rene PCR-rør. Derefter tilsættes 4 mikroliter af ormen lysis rør og bland godt ved pipetting.
Kør derefter PCR-programmet i nedenstående vejledning.
