성인 Zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총과 파인 해부 ( Danio rerio)

1 부 : 조직의 준비

1. 와 성인 zebrafish를 안락사 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금, 0.03 %) MS - 222 버퍼.
2. 물고기 목을 벨. 아래턱을 잘라 최대 복부 측면과 해부 패드에 머리를 장소, 곤충 핀으로 조직을 고정. 두개골에 복부 부드러운 조직을 제거하고 해부 현미경 하에서 미세 핀셋 한 쌍의와 두개골 캡슐의 복부 부분을 깨서.
3. 4 ° C 하룻밤에 paraformaldehyde에서 생선 머리 (4 %) 이후의 수정 프로그램입니다.
4. 3 번 5 분 때마다 (인산은 1X, 살린 버퍼) PBS에 고정 생선 머리를 씻어.

2 부 : 내이 (内耳)의 총 해부

1. 복부 측면까지 함께 해부 패드에 생선 머리를 놓습니다. 곤충 핀으로 고정. 모든 다음 단계는 해부 현미경 하에서 실시하고 있습니다.
2. 고급 핀셋 한 켤레와 내이 (内耳)를 통해 두개골 뼈를 제거하고 다음 조심스럽게 내이 (内耳)의 조직을 당겨 : saccules, lagenae 및 utricles 있습니다. saccule과 lagena가 긴밀하게 함께 서로 부착 때문에 철수하는 동안 utricle (saccule 및 lagena에 앞쪽에), 해부하는 동안 다른 쪽 끝을 기관에서 분리하는 것입니다 매우 높다.
3. PBS (1X)에서 내이 (内耳)의 조직 놔. 더 이상의 미세 절개가 필요하지 않은 경우, PBS (1X)과 조직에게 2-3 번 씻어하고는 다른 실험 예 cryosections 사용할 수 있습니다.

파트 3 : 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 훌륭한 해부

1. 미세 절개는 깨끗한 유리 슬라이드에 PBS (1X)의 드롭 수행하실 수 있습니다.
2. 고급 핀셋 두 쌍이있는 utricle에서 utricular otolith를 제거하고, 원하는 경우, 벌금 족집게 한 켤레와 바늘 블레이드와 상피 조직에서가 아닌 감각 상피 조직과 innervation을 잘라.
3. 가능한 한 그대로 전체 saccule을 유지하려고하면서 saccular 및 lagenar 상피 조직을 분리하기 전에 lagenar otolith를 제거합니다. 복부 측면까지 함께 PBS 드롭의 조직을 놓으십시오. 조심스럽게 saccule과 lagena 사이에 잘​​라 바늘 블레이드를 사용합니다. 원하는 경우, 과도한 아닌 감각 상피 조직 및 고급 핀셋과 바늘 블레이드와 innvervation를 낸다.

파트 4 : 감각 상피 조직에있는 세포의 형광 염색법

1. 3 회, 5 분 때마다 PBT (1XPBS, 1 % 트리톤 X - 100)와 감각 상피 조직을 씻어.
2. 로 상피 조직을 품어 fluophore - 라벨 phalloidin (예 : 알렉사 플라워 488 Phalloidin, 1:1,000 희석) 실온에서 30 분.
3. 3 회, 10 분 때마다 PBT와 감각 상피 조직을 씻어.
4. 미디어를 장착과 함께 슬라이드에 상피 조직을 탑재하고 적절한 파장의 필터를 형광 현미경으로 스테인드 조직을 확인하십시오.
5. 성공적인 해부와 얼룩 후, 강력한 헤어 셀 번들 얼룩과 함께 그대로 상피 조직은 현미경 (그림 1) 아래에서 볼 수 있습니다.

그림 1. saccular 감각 상피의 세포는 알렉사 밀가루 488 Phalloidin (녹색) 물들일되었습니다. 조직 샘플은 종이에 언급으로 해부와 스테인드되었습니다. 몇몇 사진은 샘플의 다른 위치에서 찍은 및 어도비 포토샵 7.0과 함께 기와되었습니다.
스케일 바 = 150μm.

이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 감각 상피 조직의 세포와 subcellular 기능을 공부에 대한 조직 샘플을 준비하는 수 성인 zebrafish의 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 매출과 미세 절개를 설명했다.

성공적인 해부, 매우 첫 번째 단계, 고정을 수행하기 위해서는 매우 중요합니다. 이전 솔루션은 절개 중에 처리하기 어려운 조직의 밑에 - 고정의 결과 때문에 항상 신선한 paraformaldehyde 솔루션을 사용할 수 있는지 확인합니다. 그러나, 그것은 절개 후 면역 / histological 얼룩의 결과에 영향을 것이기 때문에 당신이 너무 오래를위한 고정 솔루션에서 그들을 떠날하여 조직을 통해 - 수정하지 않은지 확인하십시오. 또한, 적절한 크기에 잘 유지 해부 도구를 사용하면 특히 미세 해부에 대한, 물론 중요합니다.

이 총 해부 프로토콜은 또한 조직을 특정 DNAs / RNAS / 단백질의 추출에 대한 내이 (内耳)의 조직을 취득 적용할 수 있습니다. 이 경우에는 절개가 바로 paraformaldehyde 고정하지 않고 물고기의 희생 이후에 실시해야합니다. 또한, 특정 일상적인 방법은 대상 macromolecules의 저하를 보호하는 데 사용할 수 있습니다. 조직 특정 RNA 추출에 대한 해부 동안 예를 들어, 생선 머리 (낮은 턱 제거)을 씻어서 수 있으며 다음 RNAlater 솔루션 (앰비온)에 열중.