成年斑马鱼肾脏的解剖

Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839, doi:10.3791/2839 (2011).

在成人干细胞生物学的新兴领域工作的研究人员设法了解规范的行为和干细胞的功能，在正常的动态平衡和疾病状态的信号，。成人干细胞的认识，具有广泛的深远影响， ^为再生医学的1未来。例如，更好地了解成人干细胞生物学的知识，可以方便的触发机关是医治自己， 甚至是建立在体外的器官可以^移植到人类1方法治疗策略的设计。斑马鱼已成为一个强大的动物模型，为研究脊椎动物的^细胞生物学2。已经有广泛的文档和胚胎发育中的斑马鱼³的分析。直到最近，科学家试图文件成人解剖和手术剥离技术^4，因为一直在斑马鱼的社会进步运动，以扩大本研究的有机体到成人的研究中的应用。例如，有扩大使用斑马鱼进行调查的成人干细胞群生物学和复杂的疾病，如癌症⁵成人模式的利益。从历史上看，隔离的斑马鱼成人肾脏已经为研究造血， ^肾脏是6,7鱼血细胞生产的解剖位置。肾脏是由肾功能arbo​​rized安排的单位，整个空间是分散的造血组织，包围。造血组成部分造血干细胞（HSCs）和他们的后代居住在肾脏，直到他们临终区分^8。此外，它现在是赞赏，肾干/祖细胞组（RPC）的也居住在斑马鱼的肾脏器官，使肾脏的再生和增长，为其他^鱼种 9-11观察。鉴于这一新发现，斑马鱼的肾脏是一个器官，房子的成人干细胞生物学研究的两个令人兴奋的机会的位置。它是明确的，许多悬而未决的问题，可以担任这个实验系统。为了鼓励这一领域的扩展，它是有益的文件详细的可视化方法，然后隔离成年斑马鱼的肾脏器官。该协议的细节，不固定和固定动物的成年肾解剖的过程。可用于解剖的肾脏器官，造血功能和肾功能的干细胞和它们的后代使用，如组织学，荧光激活细胞分选^{（FACS）11,12，13,14}表达谱^，并移植11,15成立技术分离和鉴定。我们希望传播，这个协议将提供的知识，以实现更广泛的使用，最终可以翻译为人类应用的斑马鱼研究的研究人员。

1。成年斑马鱼肾脏的解剖，从一个不固定的动物样本

1. 选择解剖年龄在3-6个月之间的成年斑马鱼。
2. 安乐死的鱼放入一盘0.2％Tricaine pH值7.0，约4-5分钟，仔细观察看到的鳃停止移动和心脏停止跳动。
3. 用勺子，电梯从Tricaine洗澡的鱼在少量溶液，倾倒的解决方案，轻轻地放在纸巾上的动物。
4. 使用一双解剖剪刀锋利，以消除动物的头，作出削减仅次于鳃鳃盖（图1，路径A）。丢弃在生物危险废物的容器的头部。
5. 用解剖剪刀，长腹切口，从头部开始，终止和尾鳍的基础（图1，路径B）尾巴，动物的身体打开。
6. 用一双解剖镊子/钳取出的动物内脏器官，和生物危险废物。小心勿刷背体壁，因为这是肾脏的位置（图2）。如果你选择了一个女性的鱼，你将需要舀体腔，可最容易使用产钳或镊子的角度对发展鸡蛋。
7. 使用夹层针针身体墙壁打开一个夹层托盘和角度可以可视化的针脚，使肾脏。肾脏将拥有一个形状特征（头部，躯干/鞍，尾）和色彩，穿插黑色色调的色素沉着（图2）。您还可以看到充满外周血，跑下来的器官结构的中线主动脉。
8. 用细镊子从背侧体壁分离肾脏，使用一对镊子，解除肾为你单独由结缔组织构成的器官。
9. 进一步的活体细胞的研究，如流式细胞仪准备含有1X PBS离心管，轻轻放入所需的车辆肾脏。

2。成年斑马鱼肾脏从一个固定的动物样本的制备及夹层

1. 准备了4％paraformaldehyde/1X PBST的解决方案。熬的解决方案，以溶解到溶液中的煤灰，然后冷却到4 ° C的混合物，并添加0.1％二甲。我们曾从使用新鲜的煤灰解决方案，而不是冻结等分组织保存的最成功的。淹没在夹层的成年斑马鱼做出足够的解决方案。
2. 填充足够的固定解决方案淹没在成年斑马鱼解剖一个夹层托盘。我们执行的后续步骤，在显微镜下定位托盘，可放置在化学罩，以尽量减少暴露在固定的气味。
3. 选择解剖年龄在3-6个月之间的成年斑马鱼。
4. 安乐死0.2％Tricaine pH值7.0约5分钟，成菜的鱼，仔细观察，看到的鳃和心脏停止跳动。
5. 用勺子，电梯从Tricaine洗澡的鱼在少量溶液，倾倒的解决方案，轻轻地放在纸巾上的动物。
6. 使用一双解剖剪刀锋利，以消除动物的头，作出削减仅次于鳃鳃盖（图1，路径A）。丢弃在生物危险废物的容器的头，并立即放入动物的煤灰含有夹层托盘。
7. 使用解剖剪刀打开动物的身体，长腹切口，开始从头部和尾部尾鳍的基础（图1，路径B）终止，并保持身体部分淹没在的过程。
8. 用一双解剖镊子/钳取出的动物内脏器官，和生物危险废物。小心勿刷背体壁，因为这是肾脏的位置（图2）。
9. 使用夹层针针打开身体的墙壁，和角度可以可视化的针脚，使肾脏。肾脏将拥有一个形状特征（头，鞍，尾）和色彩，穿插黑色色调的色素沉着（图2）。您还可以看到充满外周血，跑下来的器官结构的中线主动脉。
10. 一夜之间修复的样品，托盘放置在4 ° C当您安排所需的样品做。
11. 第二天，从托盘中取出的煤灰解决方案，并取代1X PBST。
12. 用细镊子仔细分离肾脏背侧体壁，使用一对镊子，解除肾为你单独器官的结缔组织构成。肾组织柔软，柔韧，从固定液DMSO，使它能够在一块的整个肾脏器官解剖。
13. 使用宽孔转移吸管放入离心管的肾。
14. 肾脏，现在可以进一步处理， 进行原位基因表达研究的基础上所需的研究的组织学或整装。

3。代表性的成果：

图解图1中的步骤表明解剖过程。肾脏可根据其形状特征和着色，以及对动物的体腔的背墙解剖位置确定，如图2所示。解剖一个固定的肾脏样品，整个装入原位杂交后，可用于本地化的一个感兴趣的基因的表达，如在图3所示。

图1：程序，使解剖斑马鱼成人肾脏的直接访问 。 （一）安乐死的斑马鱼是解剖一个循序渐进的方式（用数字和箭头表示）给研究者完整的肾脏器官的最简单的访问。腹腔的图片前，（B）和（三）去除腹部器官。

图2：在一个不固定的样本的斑马鱼肾可视以下拆除在腔体内的器官，肾脏出现一个单一的，扁平的器官是通过结缔组织 （一）背体壁贴壁，并已系统化（二）以显示其解剖形状。

图3： 在执行对整个成人肾脏器官的原位杂交装载 。 （一）cadherin17成绩单被发现在成人肾肾肾小管，扩大（一）（B）mafba成绩单本地化近端肾细胞类型，在成人的肾（比较面板整个肾小管一），（ B“ ）mafba表达的放大视图显示成绩单专门的足细胞（P）的细胞的血液过滤器（肾小球）和近曲小管（PCT）的本地化。

成人干细胞都充满活力的重要组成部分，保持成年体^形式 1 。成人干细胞也能起到抵制破坏，在疾病状态下机体所产生和成人干细胞的功能障碍或丧失，可导致器官功能衰退，并已牵连到驱动器的恶性肿瘤，并促进老化。成人干细胞表现出细胞分化的细胞类型的属性，区分他们。细胞分裂后，成人干细胞能够自我更新和祖细胞的生产，这反过来可以带来明显的区别的后代。有极大的兴趣，了解的途径，调节细胞命运的决定和成人干细胞的效力，因为其重要作用的组织^动态平衡 1 。例如，许多科学家目前正在设法确定的信号，保持各种成体干细胞在自己的优势种群，或专门的微环境，以及如何这个利基是通过体液因素的影响。

成人的造血干细胞（HSCs）是多能干细胞，燃油的不断复兴的血细胞在^动物 8 。造血是一个充满活力的过程，就是在脊椎动物的有机体的生命不断持续，因为成熟分化血细胞类型是短命的，因此必须定期补充。由于它们的分化，造血干细胞自我更新并产生了一系列的祖细胞，引起红系，巨核细胞，淋巴细胞和髓细胞谱系提供这个关键的需求。这些类型的血细胞中的每一个执行了独特的功能，在流通领域，包括组织提供的气体交换，密封血管的血凝块形成的伤害，或对入侵的病原体防御机制的一种方式，。虽然已多年公认的造血干细胞，过多的迷人问题仍然未对这些惊人的细胞。最近的研究确定了不同的长期自我更新的属性，并澄清利基元件和信号调节HSC ^的行为8的造血干细胞的子类。斑马鱼是目前造血功能的研究范式的基石，根据对这种动物模型⁸的遗传和分子属性。利用斑马鱼的研究，导致有关HSC的生物学是保守的小说，像哺乳动物的高等脊椎动物中， ^强调鱼血调查8的生物医学相关的见解。

从历史上看，有关造血干细胞知识的探险发现，如果身体其他器官是由成人干细胞维持铺平了道路。现在众多的成人干细胞群赞赏存在，在不同的结构，从大脑到肠，皮肤，骨骼肌。在干细胞领域继续努力，寻求以确定如何成人干细胞和分化的细胞，甚至其他类型，可以显示各种设置，增强药性。

对于肾脏有肾干细胞是否存在¹⁶肾科之间的大辩论。独立研究结果已经证明在哺乳动物中，具有不同程度的再生潜力的肾细胞的数量，但这些报告的凝聚力理解尚未实现。有趣的是，有强有力的证据来支持这一概念，很多鱼类物种具有细胞可以再生受损的肾强劲燃料，以及在成年期⁹成长的全新肾。最近的工作已经确定了在斑马鱼^10,11成人肾脏干细胞的分子标志，并展示了这些所谓的肾干/祖细胞（RPC） ^的 11自我更新的药效。未来的研究需要，以确定是否类似肾细胞在哺乳动物中存在。然而，有关的细胞和分子机制，调节鱼的RPC继续调查可能会提供如何可能在哺乳动物肾脏刺激再生功勋的洞察力。很明显，仍然有许多关于RPC的理解和实施的许多工具，现在提供的斑马鱼研究员可以解决这些有趣的问题。

在这个协议中，我们描述了我们的方法为肾成年斑马鱼的解剖鉴定和清扫。其他的步骤可以用来解剖肾，如使用夹层剪刀与腹侧切口打开腹腔，然而，我们所遇到的最成功的访问时腹壁固定开放和头部被删除整个肾脏。血，肾的研究人员都希望隔离，并与这些类型的细胞工作可以使用清扫方法。应当指出，我们所描述的方法，隔离和workin与斑马鱼的成人肾脏G是肯定不限于那些希望追求成人干细胞生物学的问题，作为本机关的夹层可以方便那些追求从生理老化的议题进行调查的研究人员研究的科学家。此外，这种方法可以加上其他如转基因技术，所以作为分子标签，然后净化和研究离散的从野生型或基因突变斑马鱼¹¹的血液或肾细胞亚群。展望未来，干细胞和祖细胞类型等详细的净化程序是至关重要的，以获得有关如何调节自己的行为是知识，操作测试，如移植或祖细胞培养的基础构成，这些细胞的潜能和身份的定义。在造血祖细胞培养方法的最新进展为研究打开许多新的途径，可适应培养¹⁷例肾人群。斑马鱼的化学遗传学已成功途径，调节造血干细胞，并在各种情况下的肾^祖 18-20，将继续成为一个有用的途径与上述细胞生物学技术结合测试鉴定。两者合计，有一个使用斑马鱼模型的血液和肾脏病领域的开创性贡献的数量，并继续在这些领域的研究承诺挥动进一步变革的见解，在未来几年。

没有利益冲突的声明。

原材料要感谢他们为帮助制定战略，已逐步形成夹层技术在成年斑马鱼在过去的十年的无数贡献Zon和戴维森研究实验室的成员。此外，我们希望表达我们的感激之情圣母院斑马鱼研究中心提供优秀正在进行的畜牧业照顾我们的斑马鱼殖民地的工作人员。 RAW，得到了美国国立卫生研究院NIDDK授予奖DK083512的科研经费，并从圣母大学的慷慨实验室的启动资金。

1. Stocum, D.L. & Zupanc, G.K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237 (12), 3648-71, (2008).
2. Lieschke, G.J. & Currie, P.D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-67, (2007).
3. Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullman, B., & Schilling, T.F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310, (1995).
4. Gupta ,T. & Mullins, M.C. Dissection of organs from the adult zebrafish. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1717 doi: 10.379/1717. J Vis Exp. 37 (2010).
5. Mione, M.C. & Trede, N.S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3 (9-10), 517-23, (2010).
6. Zon, L.I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
7. Davidson, A.J. & Zon, L.I. The ‘definitive’ (and ‘primitive’) guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246, (2004).
8. Orkin, S.H. & Zon, L.I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-44, (2008).
9. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
10. Zhou, W., Boucher, R.C., Bollig F., Englert, C., & Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299 (5), F1040-7 (2010).
11. Diep, C.Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H., Ikenaga, T., Ono, F., Englert, C., Cowan, C., Hukreide, N.A., Handin, R.I., & Davidson, A.J. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
12. Traver, D., Paw, B.H., Poss, K.D., Penberthy, W.T., Lin, S., & Zon, L.I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4 (12), 1238-46, (2003).
13. Weber, G.J., Choe, S.E., Dooley, K.A., Paffett-Lugassy, N.N., Zhou, Y., & Zon, L.I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106 (2), 521-30 (2005).
14. Sumanas, S., Jorniak, T., & Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106 (2), 534-41 (2005).
15. Burns, C.E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J.L., & Zon, L.I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19 (19), 2331-42 (2005).
16. Little, M.H. & Bertram, J.F. Is there such a thing as a renal stem cell? J. Am. Soc. Nephrol. 20 (10), 2112-7, (2009).
17. Stachura, D.L., Reyes, J.R., Bartunek, P., Paw, B.H., Zon, L.I., & Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114 (2), 279-289 (2009).
18. North, T.E., Goessling, W., Walkley, C.R., Lengerke, C., Kopani, K.R., Lord, A.M., Weber, G.J., Bowman, T.V., Jang, I.H., Grosser, T., Fitzgerald, G.A., Daley, G.Q., Orkin, S.H., & Zon, L.I. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-11, (2007).
19. Wingert, R.A., Selleck, R., Yu, J., Song, H.D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A.P., & Davidson, A.J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-38, (2007).
20. de Groh, E.D., Swanhart, L.M., Cosentino, C.C., Jackson, R.L., Dai, W., Kitchens, C.A., Day, B.W., Smithgall, T.E., & Hukriede, N.A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802, (2010).

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