نحن هنا وصف أساليب الكهربية لقياس انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية لليرقة ذبابة الفاكهة. أثار إطلاق سراح يبدأ بشكل مصطنع من خلال تحفيز الخلايا العصبية الحركية المحاور ، ويمكن قياسها من خلال انتقال NMJ التي أثارت استجابة بعد المشبكي في العضلات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا الفيديو ، ونحن تصف الأساليب الكهربية لتسجيل انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية (NMJ) من يرقات ذبابة الفاكهة. الجهاز العصبي العضلي اليرقات هو المشبك نموذج لدراسة علم وظائف الأعضاء متشابك والعصبي ، ويشكل أداة للبحث القيم الذي عرف علم الوراثة ، ويمكن الوصول إلى التلاعب التجريبية. يمكن تشريح اليرقات لفضح الجدار العضلي الجسم والجهاز العصبي المركزي والأعصاب الطرفية. تتميز عضلات ذبابة الفاكهة ونمطها تعصيب العضلات بشكل جيد ويسهل الوصول لتسجيل داخل الخلايا. يمكن التعرف على العضلات الفردية عن طريق موقعهم والتوجيه داخل البطن 8 قطاعات ، ولكل منها 30 مرتبة في عضلات نمطا يتكرر في قطاعات A2 -- A7. يمكن تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات عضلات رقيقة والفردية وحزم من المحاور العصبية المحركة التي يمكن تصور تضوء
البروتوكول
قبل البدء في التحضير :
- تجول yhird يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي
- HL3.1 (التعديل الدملمف الشبيهة) حل
- لوحات Sylgard تشريح (شفاف المطاط سيليكون) الذي أعد في الصغيرة (35 × 10 ملم) أطباق بتري البلاستيكية باستخدام الأساليب التي وصفها برنت ومكابي (2008) 3.
- دبابيس قطع تشريح قصيرة
- ماصات تحفيز كهربائي
- ماصات تسجيل حادة
HL3 الحل :
- خلال التشريح والتجارب الكهربية ، مغمورة في اليرقة HL3.1 الحل الذي يحتوي على 2 (مم) : 70 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 4 MgCl 2 ، 10 NaHCO 3 و 5 طرهالوز ، 115 السكروز ، وHEPES 5 ، ودرجة الحموضة 7.2.
- وأضاف تركيزات CaCl 2 إلى حل HL3.1 لتوفير تركيز الكالسيوم المطلوبة من خارج الخلية 2 +.
- يتم إجراء تشريح اليرقات في كا 2 + تركيزات منخفضة (لتجنب تقلص العضلات) باستخدام HL3.1 + 0.25 ملي CaCl 2 ، يحرص على الجليد.
- تسجل عادة في التجارب الكهربية HL3.1 + 1 ملم CaCl 2 ، ولكن يمكن تعديل هذا 0،4-1 ملي كا 2 + على النحو المطلوب.
- غير معقمة تصفية حل HL3.1 قبل الاستخدام ، وتخزينها في 4 ˚ جيم
إعداد وتحفيز تسجيل ماصات :
- يتم سحب تسجيل وتحفيز ماصات مع P - 2000 سوتر مجتذب micropipette الليزر القائمة على استخدام الإعدادات التالية : الحرارة = 390 ، الشعيرة = 4 = 35 السرعة ، والتأخر = 200 واسحب = 0.
- وتعد من أقطاب تحفيز رقيقة الجدران الزجاجية البورسليكات الشعيرات الدموية مع نهايات الواسعة التي كانت أكبر قليلا من عرض محاور المحركات قطعت. وfirepolished ينتهي على شكل لإعطاء الانتهاء من سلس (باستخدام ماصة Narashiga ملمع) ، للحد من الأضرار التي لحقت العصبية. تمتلئ تحفيز كهربائي مع الحل حمام (HL3.1 + 1 ملم كا 2 +).
- مستعدون الأقطاب تسجيل من الزجاج البورسليكات 1.2mm ، والتي يتم سحبها لتشكيل ماصة حادة (30-60 mΩ) ، ومليئة بوكل 3M.
الجزء 1 : يرقات ذبابة الفاكهة تشريح
- يتم تشريح الثالثة طور مرحلي اليرقات تجول لفضح العضلات في جدار الجسم كما هو موضح سابقا 4.
- يتم إجراء التشريح في HL3.1 + 0.25 ملي كا 2 + على لوحات صغيرة من السيليكون (35 × 10 ملم). يجب أن يكون الحل HL3.1 الجليد الباردة للتشريح من أجل تخدير اليرقة ، ويتم الاحتفاظ بها على الثلج قبل وأثناء تشريح.
- يتم تشريح اليرقات باستخدام الأساليب التي وصفها برنت ومكابي (2008) ، وهذا هو تعديل للتجارب الكهربية بإضافة 0.25 ملي كا 2 + في حل تشريح HL3.1 ، واستخدام الدبابيس تشريح قصيرة (~ 2 مم في الطول) التي هي أقل من المرجح أن تصل إلى الهدف المجهر والأقطاب الكهربائية خلال التجربة.
- بعد التشريح ، وقطعت محاور المحرك من اليرقات. يتم ذلك من خلال عقد مجلس الامن القومى برفق ورفعه قليلا بحيث يمكن قطع الأعصاب الطرفية التي يعصب العضلات الخلفية للالعقدة بطني دون الإضرار العضلات (الشكل 1). ثم تتم إزالة المخ.
- يتم غسلها إعداد اليرقات تشريح مرتين مع HL3.1 + 1 ملم كا 2 +.
الشكل 1. تخطيطي يبين الخطوات المتبعة في قطع السيارات من المحاور اليرقات تشريح. رفع الجهاز العصبي المركزي مع ملقط وتقطع المحاور الحركية في قاعدة الدماغ.
الجزء 2 : تسجيلات بين الخلايا من خلايا العضلات اليرقات.
- وضع لوحة على تشريح المجهر الكهربية وغمر الإعدادية مع HL3.1 + 1.5 ملي كا 2 + والإصلاح القطب حمام بحيث يكون على تماس مع الحل.
- وتجرى تجارب على جميع العضلات في غضون 6 الجزء البطن الثالثة (A3). يتم تحفيز الأعصاب الطرفية التي يعصب العضلات باستخدام الشفط الكهربائي 5.
- موقف القطب تحفيز في أول طبق لتجنب الاهتزازات عند القطب الخلايا في مكان. مكان القطب في تحفيز منطقة قريبة من الخلايا العصبية الحركية في العضلات 6 التعصيب وتطبيق طيف الامتصاص حتى يتم قطع العصب داخل ماصة الزجاج. يجب الحرص على عدم امتداد الأعصاب عند تطبيق الشفط. رفع ماصة قليلا حتى لا يكون لمس العضلات وضعه حتى لا يكون سحب على قطع الألياف العصبية (الشكل 2).
الشكل 2. تخطيطي للعضلات والخلايا العصبية الحركية التعصيب من جزء واحد في البطن من يرقة ذبابة الفاكهة. ويوضح موقف ماصة تحفيز الأعصاب وقطعت والقطب في تسجيل موقف في العضلات 6. - البينيةوالتسجيلات الخليوي مع microelectrodes حادة مليئة بوكل م 3. موقف القطب تسجيل فوق مركز للعضلة 6 على قطعة البطن الثالثة (A3) وضبط مدخلات يقابل ذلك فإنه يقرأ صفر من أجل حل الحمام. انخفاض ببطء الكهربائي ونهج العضلات تحت التكبير البصرية عالية حتى يلمس سطح العضلات. مشاهدة الذبذبات لتأكيد أنه تم اخترقت العضلات. ينبغي أن يستريح غشاء المحتملة على الأقل -60 بالسيارات ، أو لا ينبغي أن يكون استخدام الحيوانات. ينبغي متفرقة امكانات endplate مصغرة تكون الآن مرئية. ترك الخلية لتحقيق الاستقرار في لدقيقة واحدة قبل البدء في المحضر.
- تم الكشف عن التغييرات المحتملة في الغشاء مع رئيس أكسون المرحلة HS - 2A و 2B Axoclamp مكبر للصوت وسجلت مع v Clampex 8.2.0.235 (أكسون الآلات). و2B Axoclamp هو ربطه إلى الكمبيوتر الذي يدير برنامج pCLAMP ويعمل جنبا إلى جنب مع واجهة 1322A Digidata.
- وسجلت الخلايا لمدة 3 دقائق من دون أي مؤثرات لقياس ردود mEJP. وقد تم تحليل آثار البسيطة باستخدام برامج التحليل (Synaptosoft ، والخامس 6.0.3) والسعة والتردد mEJP تحديدها.
تحفيز العصب :
- ويتم تحفيز نهاية المقطوعة من الخلايا العصبية الحركية مع سلسلة من نبضات الجهد مربع (0.3 مللي ثانية مدتها) على كثافة غير كافية لكل من المحاور الحركية ، لتستثير استجابات متسقة في العضلات كلها.
- يتم إنشاء التحفيز مع ماجستير - 8 مولد النبض ، وهو مبرمج لتوصيل نبضات مستمرة وفقا للمدة والأوقات الفاصلة.
- سماح لمدة خمس ثوان بين المحفزات لتحقيق الانتعاش في NMJ متشابك.
- عند تحديد قوة الحافز ، وتبدأ مع أدنى مستوى لها ، وزيادة كثافة ببطء على مدى عدة محاكمات. وينبغي أن تستخدم لشدة التحفيز النتائج في الحد الأدنى الذي أثار رد فعل في التجارب.
- عندما يتم التوصل إلى شدة الحوافز المناسبة ، ينبغي أن يكون هناك واحد EJP مجمع واحد تقلص العضلات التي حركها التحفيز.
- سجل ما لا يقل عن 10 من كل الامكانيات أثار العضلات وسعة المتوسط.
الجزء 3 : النتائج الممثل
الشكل 3. تسجيل الخلايا العضلية من الممثل 6 تبين أثار EJP هو استجابة لالتحفيز الكهربائي للعصب قطعي ، وإمكانات متفرقة endplate مصغرة ، أو لmEJP. EJP في العضلات سعة 6 من اليرقات من النوع البري صحية ، مثل S كانتون ، وعادة ما تكون حوالي 40 فولت وسعة mEJP بين بالسيارات 1-3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصفت وسائل هنا توفر طريقة سريعة نسبيا واسعة للكشف عن تغيرات في وظيفة متشابك في NMJ. القدرة على أداء التسجيلات الكهربية باستخدام حيوانات سليمة في الجسم الحي ، وتأدية معالجات وراثية أو دوائية ، وجعل ذبابة الفاكهة نموذجا مثاليا للحيوان التحقيق في الجوانب الفسيولوجية والجينية لالعصبي.
منذ خلايا عضلة كبيرة جدا ، قد يفضل البعض إضافة إلى خطوة إضافية لهذا البروتوكول لمدة تسجيل الجهد الكهربائي (TEVC) المشبك. ويمكن تنفيذ ه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق بتري صغيرة (35 × 10 مم) | BD Biosciences | 1008 | |
| طقم بوليمر السيليكون المرن SYLGARD 182 | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| مجهر تشريحي | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| إضاءة المجهر | Schott AG | KLI500 | |
| دبابيس التشريح | فاين ساينس تولز (Fine Science Tools) | 26002-10 | |
| برنامج pClamp 9 | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| مقصات التشريح: مقصات فاناس الزنبركية 3 مم | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| ملقط Dumont SS | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| ملقط دومونت رقم 5 (Dumont #5 Forceps) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| أنابيب شعرية من زجاج البوروسيليكات رقيقة الجدران، مع فتيلة (1.0 ملم، 4 بوصات) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| أنابيب شعرية من زجاج البوروسيليكات، مع فتيلة (1.2 مم، 4 بوصات) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| جهاز سحب الماصات الدقيقة المعتمد على الليزر Sutter P-2000 | شركة Sutter Instrument Co. | طراز P-2000 | |
| جهاز صقل الماصات | ناريشيغي إنترناشيونال (Narishige International) | MF-83 | |
| وحدة الرأس Axon HS-2A | Molecular Devices | طراز HS-2A | |
| أجهزة التلاعب الدقيق | شركة Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| مضخم Axoclamp 2B | موليكولار ديفايسز (Molecular Devices) | AXOCLAMP 2B | |
| برمجيات Clampex | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| برنامج التحليل المصغر. الإصدار 6.0.3 | سينابتوسوفت (Synaptosoft) | ||
| مضخم براونلي الدقيق (Brownlee Precision Amplifier) | براونلي | طراز 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO₃3 | Sigma-Aldrich | s6297-1كجم | |
| تري هالوز | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| السكروز | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| هيبس (HEPES) | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl₂·6H₂O2أو | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl₂2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| مولد نبضات Master-8 | A.M.P.I | ||
| طاولة اهتزاز لإعدادات الفسيولوجيا الكهربائية | شركة التصنيع الفني (Technical Manufacturing Corp.) | ||
| قفص فاراداي |
المراجع
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
