معالجة Loblolly باين PtGen2 ميكروأري [كدنا]

Summary

وضعت [كدنا] [ميكروأري PtGen2 للدراسات التعبير الجيني في loblolly الصنوبر ، P. taeda ، والأنواع الأخرى الصنوبرية. هنا ، ونعرض ما قبل وما بعد التهجين المناولة وغسل التقنيات التي يمكن استخدامها مع هذه المجموعة لانتاج أفضل الاتساق والتحف المنخفض ، وانخفاض الخلفيات.

Abstract

PtGen2 هو ميزة [كدنا] [ميكروأري 26496 تحتوي على تضخيم الصنوبر loblolly التكنولوجيات السليمة بيئيا. وينتج الصفيف في مختبرنا للاستخدام من قبل الباحثين الذين يدرسون التعبير الجيني في الأنواع الصنوبرية الصنوبر وغيرها. وقد وضعت PtGen2 نتيجة لجهودنا اكتشاف الجينات في loblolly الصنوبر ، وتتألف من سلاسل المحددة أساسا من أنسجة الجذر ، ولكن أيضا من إبرة والخلايا الجذعية ، وقد تم اختباره من قبل ^1،2 PtGen2 التهجين المختلفة المستهدفة الصنوبرية CY - صبغ المسمى cDNAs ، باستخدام كل من تضخيمها وتضخيم عدم وضع العلامات ، طرق غير مباشرة ، واختبارها أيضا مع عدد من الشروط التهجين والغسيل. هذا الفيديو يركز على معالجة وتصنيع الشرائح قبل وبعد مرحلة ما قبل التهجين ، وكذلك بعد التهجين ، وذلك باستخدام بعض التعديلات على الإجراءات التي وضعت سابقا. ^3،4 شملت أيضا ، في شكل النص فقط ، هي البروتوكولات المستخدمة للجيل ، وضع العلامات وتنظيف الهدف من ليالي [كدنا] ، وكذلك معلومات عن البرمجيات المستخدمة لمعالجة البيانات المصب.

طبعت PtGen2 مع العازلة طباعة الشخصية التي تحتوي على تركيزات عالية من الملح يمكن أن يكون من الصعب إزالته تماما. تغسل الشرائح الأولى في حل SDS الدافئ قبل قبل التهجين. بعد التهجين المسبق ، تغسل الشرائح بقوة في العديد من التغييرات من المياه لاستكمال إزالة الأملاح المتبقية. ثم يتم تنظيف LifterSlips ™ ووضعها على الشرائح والمسمى [كدنا] تحميل بعناية وعلى ميكروأري عن طريق العمل الشعري الذي ينص على توزيع العينة حتى عبر الشريحة ، ويقلل من فرصة التأسيس الفقاعة. يتم تهجين من الأهداف إلى الصفيف في 48 درجة مئوية في ظروف الرطوبة العالية. بعد التهجين ، يتم إجراء سلسلة من يغسل قياسية بلغت 53 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة لفترات طويلة. تجهيز PtGen2 الشرائح باستخدام هذا الأسلوب يقلل من الملح وSDS المستمدة من التحف غالبا ما ينظر إليها عند معالجة مجموعة أقل صرامة. التهجين الأهداف المستمدة من مصادر مختلفة عدة RNA الصنوبرية ، أسفرت عن عدد أقل من هذا البروتوكول تجهيز القطع الأثرية ، الخلفية مخفضة ، وتقديم أفضل الاتساق بين المجموعات التجريبية المختلفة من الالواح.

Protocol

(لاحظ الأقسام 1-4 لم تظهر في فيديو)

إعداد CY - إعتبر الهدف [كدنا]

ما يلي هو البروتوكول الذي نستخدمه في التوليف [كدنا] من الحمض النووي الريبي مجموع loblolly الصنوبر ووضع العلامات غير المباشرة قبل [كدنا] [ميكروأري التهجين. رغم ما اتخذ من عدد قليل من غير تافهة تعديلات بروتوكول أدناه مماثلة لتلك التي في دليل التعليمات المتوفرة مع Invitrogen مرتفع غير المباشرة في مجموعة وصفها [كدنا].

الجزء 1 : لأول رد فعل ستراند التجميعي [كدنا]

<....

Discussion

PtGen2 هو ، والعرف وضعت مؤخرا [كدنا] [ميكروأري التي تم تصميمها ليتم استخدامها في المقام الأول من قبل المجتمع البحوث loblolly الصنوبر. النتائج الأولية ولدت حتى الآن أظهرت الصفيف إلى أن تكون أداة قيمة في تقييم الأحداث التي تحدث في الترانسكربتي استجابة لضغط الجفاف ، وكذلك في رصد التغيرات التي تحدث أثناء تطور الجنين في الصنوبر البحري ، صنوبر pinaster ^5،6 لدينا كما أظهرت مؤخرا أن PtGen2 يعمل بشكل جيد في التهجين باستخدام عينات الأنواع المستهدفة عبر عزلها عن مجموعة مت.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
المخزن			المؤقت للتهجين المسبق	5X SSC ، 0.1٪ SDS ، 1٪ BSA
Hybridization Buffer				Buffer 30٪ فورماميد ، 5X SSC ، 5X Denhardt ق ، 1٪ بوليا الحمض النووي الريبي (Invitrogen ، POLYA. GF) ، 0.1٪ SDS
Wash Solution # 1	Buffer			1X SSC ، 0.2٪ SDS ، التسخين المسبق إلى 43 ° ؛
C Wash Solution # 2	Buffer			0.1X SSC ، محلول غسيل SDS 0.2٪
# 3	Buffer			0.1X SSC
كاشف كحول الأيزوبروبيل		Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50 مل أنابيب مخروطية	أخرى	Falcon BD	352070
15 مل أنابيب مخروطية	أخرى	Falcon BD	352196	استخدم هذا الغطاء أو غطاء مشابه يوضع في الجزء السفلي من كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل أثناء الطرد المركزي
طبق تلطيخ كوبلين جرة		ويتون	900520
رف	آخر	Wheaton	900200
ألبومين من مصل الأبقار (BSA)	أخرى	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA. مجموعة وضع العلامات على الحمض (cDNA) غير المباشر GF
SuperScriptTM		Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase	Kit	Ambion	AM1907
System
Cy-5 كاشف صبغ		GE Healthcare	PA25001
Cy-3	كاشف	صبغ GE Healthcare	PA23001
LifterSlips&# 8482;	معدات	GeneMachines الأخرى من Erie Scientific	25X601
HybChambers	GeneMachines		JHYB200003