مقالة منهجية

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

14.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/1206

⸱

مارس 13, 2009

 ,  , 
1Department of Biology, University of Waterloo

في هذه المقالة

ملخص

ويقدم طريقة بسيطة وغير مكلفة وفعالة للتحضير للأجنة ذبابة الفاكهة تعيش التصوير التحليل. بروتوكول يتيح لنا الرطوبة والغاز والصرف لا ضغط الجنين ذبابة الفاكهة. هذا الأسلوب هو مناسبة لGFP القائم على التصوير المباشر للأجنة ذبابة الفاكهة باستخدام stereomicroscope أو تستقيم المجهر المركب.

الملخص

الأخضر ببروتين (GFP) المستندة timelapse الحية هي تقنية التصوير القوية لدراسة التنظيم الجيني للعمليات الحيوية مثل الأنسجة التشكل ، خلية التصاق الخلايا ، أو موت الخلية. يتم تصويرها بسهولة أجنة ذبابة الفاكهة معربا عن GFP باستخدام المجهر مجسمة أو مبائر. والهدف من أي بروتوكول الحية التصوير للحد من الآثار الضارة مثل الجفاف ونقص الأكسجين. وقد شملت البروتوكولات السابقة لإعداد أجنة ذبابة الفاكهة لحية التصوير تحليل وضع الأجنة dechorionated في مجال النفط والهالوكربون يقحم عليها بين الهالوكربون الغاز نفاذية الغشاء وساترة a

البروتوكول

إعداد

  1. جمع الأجنة على مستوى لوحات أجار عصير العنب 4. وهو ملائمة لاستخدام الآلية ذبابة الفاكهة جامع البيض (Flymax العلمية معدات المحدودة). متزامن باستخدام نظم مجموعات الجنين وتقليل عدد dechorionations التي يجب تنفيذها من أجل الحصول على أعداد كافية من الأجنة في هذه المرحلة التنموية المنشودة.
  2. إعداد شريحة dechorionation عن طريق ربط قطعة من الشريط على الوجهين إلى شريحة المجهر ، وإزالة الدعم من الشريط.
  3. إعداد غرفة التصوير العيش عن طريق قطع قطعة من النسيج لتناسب في البئر للغرفة. مكان النسيج في البئر والرطب مع الماء المقطر.
  4. مزيج النفط الهالوكربون سلسلة اللزوجة (الهالوكربون منتجات شركة) 700 وسلسلة 56 في نسبة 1:1. ويمكن تخزين واستخدام خليط غير مسمى.
  5. المكان عدة قطرات صغيرة من النفط الهالوكربون على سطح ساترة (22 X 40 مم ، رقم 2). حجم يست حرجة لكنها يجب أن تكون في ترتيب ميكرولتر 20-40.

إجراء

  1. مع المعونة من stereomicroscope ، وجمع من الأجنة لوحات عصير العنب أجار باستخدام زوج من المجوهرات ملقط (رقم 5) أو فرشاة الطلاء دقيقة للغاية. أجنة تميل إلى التمسك ببعضها البعض ونصائح للملقط '؛ يتجمع بسهولة في كتل.
  2. مع المعونة من stereomicroscope ، وانخفاض بلطف كتل من الأجنة التي انضمت الى نصائح من ملقط على سطح الشريط على الشريحة dechorionation.
  3. مرة أخرى باستخدام stereomicroscope ، دفع برفق أو السكتة الدماغية الأجنة مع الجانب من الملقط من أجل كسر فتح المشيماء الخارجي شمعي بدون تمزق الغشاء المحي الداخلية (الجنين سوف تنفجر إذا ما تمزق الغشاء المحي).
  4. بمجرد تمزق المشيماء الخارجي ، ندف الجنين من المشيماء ؛ الجنين dechorionated يميل إلى الانضمام إلى السطح من الملقط. الحرص على تجنب لمس الجنين dechorionated على سطح الشريط.
  5. حالما يتم dechorionated الجنين ، ونقل بسرعة إلى انخفاض معدة مسبقا من النفط الهالوكربون على ساترة. تلمس غيض من يحمل ملقط الجنين dechorionated إلى السطح من الهالوكربون انخفاض اسعار النفط -- وهذا يزيح الجنين من الملقط في النفط.
  6. تأكيد نقل الجنين الى انخفاض اسعار النفط. ويمكن القيام بذلك مع بالعين المجردة بشرط أن تعمل على خلفية سوداء ، واستخدام مصدر الإضاءة الألياف البصرية التي وضعت في زاوية مائلة.
  7. قبل محاولة أخرى dechorionate جنين ونظيفة من أي نفط ملقط. ملقط المغلفة في شراء النفط أقل على سطح المشيماء ، مما يجعل dechorionation أكثر صعوبة.
  8. Dechorionated الأجنة هي في مجال النفط المزدهر الهالوكربون. باستخدام الملقط أو الفرشاة ألف وأثناء عرض خلال stereomicroscope ، ودفع الجنين إلى أسفل من انخفاض اسعار النفط وترتيب في الموضع المطلوب.
  9. عكس بسرعة ساترة على مدى جيدا للغرفة التصوير الحي. تأكد من أن الأجنة يستريح ضد ساترة في الاتجاه المطلوب. نظرا لحيويتها في مجال النفط ، سوف تطفو على أجنة الآن ضد السطح السفلي للساترة. إصلاح ساترة إلى غرفة التصوير العيش مع الشريط. تهوية الغرفة بقطع ثقوب في الشريط في المنطقة التي تمتد على الشريط الفجوة بين نهاية ونهاية ساترة من البئر للغرفة التصوير الحي.
  10. ويمكن الآن مجهر مضان تستقيم أو stereomicroscope مضان يمكن استخدامها لصورة الأجنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن تصف طريقة جديدة لإعداد أجنة ذبابة الفاكهة لتحليل التصوير الحي ، الذي نسميه بروتوكول قطرة شنقا. لسوء الحظ ، فإنه ليس من الممكن استخدام بروتوكول إسقاط عقوبة الاعدام شنقا اذا عمل مع مجهر مقلوب. ويجب في هذه الحالة يمكن استخدام هذه التقنية يقحم (كما هو موضح في أعلاه مجردة) ، وضغط من الأجنة لا تزال مصدرا للقلق.

في التجارب حيث يتم قياس حجم وشكل خلية لحساب القوات التابعة لحركة التخلق ، واستخدام المجهر تستقيم وبروتوكو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

نحن نعترف بامتنان الدعم لBHR من خلال منحة ديسكفري فضلا عن أدوات البحث والمنح الصك من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC). نعترف أيضا H. أودا وذبابة الفاكهة بلومينغتون المخزون مركز لتوفير مخزونات الجينية التي تم استخدامها في تسلسل سبيل المثال التصوير الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

التجهيزات القياسية والمواد المطلوبة للتحضير لتصوير الأجنة يعيش باستخدام بروتوكول قطرة شنقا تتضمن العناصر التالية : شرائح المجهر ، coverslips (22 × 40 مم ، رقم 2) ، والشريط على الوجهين ، ملقط المجوهرات (دومون رقم 5 نمط ) ، الهالوكربون النفط سلسلة 56 وسلسلة 700 (الهالوكربون منتجات شركة) ، سكين الأداة أو شفرة حلاقة واحدة الحافة ، والمناديل الورقية ، مقص ، والماء المقطر ، الشريط العامة الغرض ، ومناسبة لتقديم الماصة ميكرولتر 20-40. بروتوكول التصوير العيش يتطلب أيضا مصنوعة خصيصا غرفة التصوير الحي. الذي أعد هذه بقطع 5 مم اعتقد البولي ورقة من البلاستيك لأبعاد شريحة المجهر القياسي (75 X 25 مم) ، واستخدام الدوار لإنشاء الاكتئاب العميق 3mm في الشريحة (20 X 55 مم). الوصول إلى stereomicroscope (تشريح المجهر) ، ومطلوب أيضا مصدر إضاءة من الألياف الضوئية.

المراجع

  1. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
  2. Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
  3. Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
  4. Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة