مقالة منهجية

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

23K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/1229

⸱

مارس 25, 2009

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

في هذه المقالة

ملخص

جبل بأكمله في الموقع التهجين هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية. هنا ، نقدم قرار عالية الفلورسنت مزدوجة في البروتوكول الموقع التهجين لتحليل نمط التعبير الدقيق لجين واحد وتحديد مجالات التداخل في التعبير عن اثنين من الجينات. نحن تتضمن يوديد النووية propidium مكافحة وصمة عار لتسليط الضوء على تنظيم الأنسجة.

الملخص

جبل بأكمله

البروتوكول

1. تثبيت و

  1. الإصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني.
  2. إزالة الإصلاح ويغسل 2 × برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. dechorionate يدويا الأجنة في برنامج تلفزيوني في لوحة من الزجاج الاكتئاب باستخدام الملقط ساعاتي. بعد dechorionation ، يتم نقل الأجنة باستخدام الزجاج المصقول النار باستور ماصة لأنها قد التمسك ماصات البولي بروبلين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول المعروضة هنا يعمل بشكل جيد مع التحقيقات التي تعطي إشارة قوية نظيفة بعد تلطيخ عن 30-45 دقيقة في الفوسفاتاز القلوية ، توسطت فيه رد فعل نموذجي. قبل تنفيذ بروتوكول فلوري التهجين في الموقع ، ونحن لدينا دائما اختبار تحقيقات باستخدام معيار غير الفلورسنت البروتوكول (المنصوص عليها في المواد التكميلية جنبا إلى جنب مع لجنة التحقيق بروتوكول التوليف). لقد كان لدينا أقل نجاحا مع فلوري التهجين في البروتوكول الموقع عند استخدام مجسات الأضعف ، ولكن قد يكون من الممكن في بعض الحالات. لقد نجح.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

نود أن نعترف إسهامات جوليتش ​​Dörthe ، الجولة جنيفر وأندرو مارا في تطوير هذا البروتوكول. دعم البحوث المقدمة من معاهد الصحة القومية ، والجمعية الأميركية للسرطان ، ومارس من الدايمات.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول بارافورمالدهيد 16%، درجة EMElectron Microscopy Sciences15710يُخفف إلى 4% في PBS بتركيز 1.33x (التركيز النهائي 1x). يُحفظ في حصص مقدار 2ml عند –20°C
بروتينيز K، درجة PCR مأشوبةRoche Group03115879001يُحضّر محلول مخزون بتركيز 20mg/ml في الماء. يُحفظ في حصص مقدار 1ml عند –20°C
كاشف حجب (Blocking Reagent)Roche Group11096176001يُحضّر محلول مخزون بتركيز 10% في محلول حمض الماليك المنظم بتركيز 1x. يُحفظ في حصص مقدار 50ml عند –20°C. مستقر عبر عدة دورات من التجميد والإذابة.
Anti-Fluorescein-POD، قطع FabRoche Group11426346910تُقسم إلى حصص وتُحفظ عند -20°C. تُحفظ حصة واحدة للعمل عند 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD، قطع FabRoche Group11207739910كما ورد أعلاه.
نظام TSA Plus FluoresceinPerkinElmer, Inc.NEL741001KTتُحضّر كل قارورة من كاشف TSA عند الحاجة فقط. تُذاب في 60μl DMSO. تُحفظ عند 4°C.
نظام TSA Plus Cyanine5PerkinElmer, Inc.NEL745001KTكما ورد أعلاه
نظام TSA Plus Cyanine3PerkinElmer, Inc.NEL744001KTكما ورد أعلاه
طقم TSA رقم 16 تيراميد AlexaFluor647 (بالإضافة إلى HRP-goat-anti-rabbit IgG)Molecular Probes, Life TechnologiesT20926يُذاب كاشف التيراميد في 150μl DMSO، ثم يُقسم إلى حصص ويُحفظ عند –20°C.
خالٍ من RNase وDNaseRoche Group11119915001مُوفر كمحلول بتركيز 500μg/ml
يوديد البروبيديوم (Propidium Iodide)Molecular Probes, Life TechnologiesP-3566مُوفر كمحلول بتركيز 1mg/ml في الماء.

المراجع

  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة