مقالة منهجية

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

DOI:

10.3791/1229

⸱

مارس 25, 2009

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جبل بأكمله في الموقع التهجين هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية. هنا ، نقدم قرار عالية الفلورسنت مزدوجة في البروتوكول الموقع التهجين لتحليل نمط التعبير الدقيق لجين واحد وتحديد مجالات التداخل في التعبير عن اثنين من الجينات. نحن تتضمن يوديد النووية propidium مكافحة وصمة عار لتسليط الضوء على تنظيم الأنسجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جبل بأكمله

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تثبيت و

  1. الإصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني.
  2. إزالة الإصلاح ويغسل 2 × برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. dechorionate يدويا الأجنة في برنامج تلفزيوني في لوحة من الزجاج الاكتئاب باستخدام الملقط ساعاتي. بعد dechorionation ، يتم نقل الأجنة باستخدام الزجاج المصقول النار باستور ماصة لأنها قد التمسك ماصات البولي بروبلين.
  4. نقل الأجنة من خلال سلسلة من 25 ٪ و 50 ٪ و 75 ٪ في الميثانول برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  5. استبدال الميثانول السائل مع 100 ٪ ، واحتضان 5 دقائق ثم استبدال الميثانول النقي.
  6. أجنة في مكان -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ساعة واحدة. (ونحن عادة احتضان الأجنة بين عشية وضحاها. قياسي في الموقع التهجين ستعمل على الأجنة تخزينها لأكثر من عام ، لكننا لم تتناول ما إذا كان فقدان القرار عالية من فلوري التهجين في الموقع للتخزين لفترات طويلة.)
  7. غسل الأجنة لمدة 5 دقائق في كل من 75 ٪ و 50 ٪ و 25 ٪ في الميثانول في PBST RT. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل PBST في RT.
  8. الإصلاح مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني في RT.
  9. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل PBST في RT.

مذكرة بشأن PFA :
نقوم بتخزين PFA 4 ٪ في aliquots في C -20 درجة مئوية (انظر الجدول الكواشف). لتثبيت الأولي ، ونحن نستخدم فقط PFA التي لم تكن أبدا إذابة سابقا. تثبيتات لاحقة ، ونحن غالبا ما تستخدم PFA التي تم إذابة سابقا. التثبيت الأولي يبدو أن تكون حاسمة لتلطيخ ناجحة مع هذا البروتوكول.

2. بروتين وPOSTFIXATION

  1. K هضم مع بروتين (5μg/ml في PBST) في RT لمدة 3 إلى 12 دقيقة لpermeabilize الأجنة. (فترة حضانة يعتمد على عمر الجنين ومراحل الشباب أكثر حساسية ، ويعتمد أيضا على مجموعة من الإنزيمات.) للحصول على أجنة somitogenesis المرحلة ، ونحن permeabilize عادة لمدة 3-4 دقائق. خلال هذه الحضانة ونحن نرسي أنبوب microcentrifuge على جانبها.
  2. شطف لفترة وجيزة في PBST ويغسل مرة واحدة لمدة 5 دقائق في PBST.
  3. الإصلاح مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني في RT.
  4. تغسل مرتين ، لمدة 5 دقائق لكل منهما ، في PBST في RT.

3. PREHYBRIDIZATION

  1. احتضان الأجنة لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية في HYB.
  2. Prehybridize عند 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 في ساعة HYB +.

4. تهجين

  1. إزالة كافة ولكن 50 ميكرولتر من preHYB ، ولكن تأكد للحفاظ على الاجنة مغمورة تماما.
  2. إضافة 1-2 ميكرولتر من كل riboprobe (digoxygenin وفلوريسئين المسمى riboprobes) إلى الأجنة والمزيج بلطف بواسطة عبها الأنبوب. كمية التحقيق هو عادة 1 - 2μl من رد فعل التوليف 20μl التحقيق.
  3. وبالنظر إلى أن فلوريسئين الحساسة للضوء ، ينبغي أن تكون ملفوفة في احباط أنابيب الألومنيوم أو خلاف ذلك تتعرض للضوء الحد الأدنى من هذه النقطة إلى الأمام.
  4. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.

5. إقالة PROBE

علما بأن الحلول من هذا النقص المنظفات النقطة. القضاء على المنظفات ويبدو أن ردود الفعل تلطيخ مساعدة ولكن لا يتسبب في الأجنة لتصبح لزجة نوعا ما.

  1. إزالة riboprobe.
  2. غسل 2 × 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية في formamide/2xSSC 50 ٪.
  3. يغسل لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية في SSC × 2.
  4. يغسل لمدة 30 دقيقة 65 درجة مئوية في SSC X 0.2.

6. ANTI - فلوريسئين الضد الحضانة

  1. كتلة ما لا يقل عن 1 في ساعة RT في 500μl من محلول حمض المالئيك 1X العازلة زائد 2 ٪ كاشف حظر (انظر الجدول الكواشف).
  2. إضافة الأضداد المضادة للفلوريسئين - POD ، كما تم توفيره من قبل شركة روش ، في التخفيف 1:500 في حل حظر.
  3. يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة ونحن نرسي أنبوب microcentrifuge على جانبها.
  4. يغسل 4 × 20 دقيقة في 1X العازلة حمض المالئيك. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل برنامج تلفزيوني.

7. كشف فلوريسئين - صفتها PROBE

  1. احتضان 30-60 دقيقة في محلول TSA فلوريسئين بلس. نحن نرسي (سبين أسفل الركيزة TSA قبل اتخاذ حل تلوين ، وللاطلاع على رد الفعل ، وتمييع كاشف tyramide 01:50 بيركن في التضخيم إلمر العازلة مخفف.) خلال هذه الحضانة ، وأنبوب microcentrifuge على جانبها. يجب تحديد وقت رد الفعل تجريبيا لكل التحقيق. للأسف ، لا يمكن أن يكون رد الفعل تلطيخ رصد بصريا كما هو الركيزة الفلورسنت ، واحد وسوف نرى في كل مكان في جميع أنحاء مضان أخضر التفاعل تلطيخ.
  2. يغسل لمدة 10 دقيقة في كل من 30 ٪ ، 50 ٪ ، 75 ٪ و 100 ٪ في برنامج تلفزيوني الميثانول.
  3. احتضان في حل من 1 ٪ H 2 0 2 في الميثانول لمدة 30 دقيقة لإبطال نشاط البيروكسيديز الأولى.
  4. يغسل كل 10 دقائق في 75 ٪ و 50 ٪ والميثانول بنسبة 30 ٪ في برنامج تلفزيوني. ثم يغسل مرتين لمدة 10 دقيقة في كل برنامج تلفزيوني. فمن المهم أن كل من التقىيمكن إزالة hanol.

ملاحظات على التضخيم SIGNAL TYRAMIDE :
لقد تم استخدام إلمر بيركن أطقم TSA. نجد أن ركائز اليكسا - Tyramide صمة جيدا باستخدام التضخيم إلمر بيركن العازلة مخفف ، ولكن لم يكن لدينا النجاح باستخدام العازلة تلطيخ المتوفرة مع أطقم مجسات Invitrogen / الجزيئية. أخيرا ، وجدنا أن يتم القضاء على Cy5 مضان لاحقة الميثانول / H 2 O 2 العلاج بينما فلوريسئين واليكسا 647 - تتأثر. ويمكن أيضا أن تتأثر سلبا Cy3 من الميثانول / H 2 O 2 العلاج كما هو متعلق هيكليا لCy5. لهذا السبب ، ينبغي أن لا Cy3 وردود الفعل Cy5 TSA أن تستخدم للتفاعل تلطيخ الثانية في الفلورسنت مزدوجة في البروتوكول الموقع.

8. ANTI - Digoxygenin الضد الحضانة

  1. كتلة الأجنة مرة أخرى لمدة لا تقل عن 1 في ساعة RT في محلول حمض المالئيك 1X العازلة زائد 2 ٪ كاشف حظر.
  2. إضافة الأضداد المضادة POD - DIG كما قدمتها شركة روش في التخفيف 1:1000 في عرقلة الحل أعلاه
  3. يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة ونحن نرسي أنبوب microcentrifuge على جانبها.
  4. يغسل 4 × 20 دقيقة في 1X العازلة حمض المالئيك. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل برنامج تلفزيوني.

9. كشف Digoxygenin - صفتها PROBE

  1. نحن نرسي احتضان 30-60 دقيقة في TSA بلس Cy5 محلول (سبين أسفل الركيزة TSA قبل اتخاذ حل تلوين ، وللاطلاع على رد الفعل ، وتمييع كاشف tyramide 01:50 العازلة في التضخيم مخفف) وخلال هذه الحضانة ، وأنبوب microcentrifuge على جانبها. يجب تحديد وقت رد الفعل تجريبيا لكل التحقيق.
  2. يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في كل PBST.

10. PROPIDIUM يوديد تلطيخ

  1. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل من محكمة أمن الدولة × 2.
  2. احتضان الأجنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 50 ميكرولتر SSCT × 2 مع 10 ريبونوكلياز ميكرولتر (لتركيز النهائي من 100μg/ml).
  3. غسل ست مرات لمدة 3 دقائق في كل من محكمة أمن الدولة في RT × 2.
  4. وصمة عار الأجنة لمدة 8 دقائق في محلول يوديد propidium 330μg/ml في SSC × 2.
  5. غسل ست مرات لمدة 3 دقائق في كل من محكمة أمن الدولة في RT × 2.
  6. الإصلاح لمدة 20 دقيقة في PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني في RT.
  7. تغسل مرتين ، لمدة 5 دقائق لكل منهما ، في PBST في RT.

11. متزايد

  1. احتضان الأجنة لمدة 10 دقيقة في كل من 25 ٪ و 50 ٪ في الجلسرين PBST. واضح بين عشية وضحاها في الجلسرين 75 ٪ عند 4 درجة مئوية.
  2. ونحن تشريح deyolk الأجنة وجبل مسطح منهم على شريحة المجهر. يمكن أن تنتج كبيرة صفار مضان الخلفية. تشريح هو أسهل بكثير بعد أجنة مسحت ovenight في gylcerol.

الحلول :

PBST PBS توين زائد 0.1 ٪
SSCT SSC زائد توين 0.1 ٪
HYB - 50 ٪ formamide
5xSSC
0.1 ٪ توين - 20
HYB + HYB -
5mg/ml بالمستخفيات (خميرة) RNA
50μg/ml الهيبارين 		مستعدة RNA بالمستخفيات بواسطة بروتين الهضم K من الحمض النووي الريبي لاحقة مع الفينول ، الفينول كلوروفورم ، وعجلت كلوروفورم extraction.The RNA والذائبة في الماء DEPC المعاملة.
1 × العازلة حمض المالئيك 150mM حمض المالئيك ، 100mM كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.5)

figure-protocol-1

الشكل 1. نتائج ممثل جبل بأكمله الفلورسنت مزدوجة في الموقع التهجين. (AC). الصور تدل على باب واحد متحد البؤر من خلال المنطقة الخلفية من الزرد الجنين في مرحلة العشر الجسيدة. ومن وجهة النظر مع الظهرية الأمامية إلى الأعلى. ملطخة النوى مع يوديد propidium زرقاء اللون. (A) تم الكشف عن deltaC مرنا باستخدام riboprobe digoxygenin المسمى وكاشف TSA - Cy5. (ب) من كتب مرنا الجين her1 تم الكشف مع riboprobe فلوريسئين المسمى وكاشف TSA - فلوريسئين. (ج) دمج قنوات خضراء وحمراء لا لبس فيها تحدد مناطق مختلفة التعبير الجيني أو تداخل الجينات اثنين. (D ، E) تفاصيل her1 التعبير يدل على دقة عالية من هذا الإجراء. يمكن أن يكون مرنا للتوطين التحت خلوية تمييزها بوضوح. السهام تشير إلى خلية نشطة معرض النسخ ، التي كشفت عنها نقاط من تلطيخ في النواة. سهام تشير إلى وجود خلية حشوية تظهر الترجمة من مرنا. (F ، G) مزدوج لتلطيخ her1 وdeltaC يكشف الخلايا التي يتم تدوين كل من الجينات (رأس السهم الأبيض) ، أو بإحدى هاتين العقوبتين الجين بشكل منفصل (السهام الحمراء والخضراء).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول المعروضة هنا يعمل بشكل جيد مع التحقيقات التي تعطي إشارة قوية نظيفة بعد تلطيخ عن 30-45 دقيقة في الفوسفاتاز القلوية ، توسطت فيه رد فعل نموذجي. قبل تنفيذ بروتوكول فلوري التهجين في الموقع ، ونحن لدينا دائما اختبار تحقيقات باستخدام معيار غير الفلورسنت البروتوكول (المنصوص عليها في المواد التكميلية جنبا إلى جنب مع لجنة التحقيق بروتوكول التوليف). لقد كان لدينا أقل نجاحا مع فلوري التهجين في البروتوكول الموقع عند استخدام مجسات الأضعف ، ولكن قد يكون من الممكن في بعض الحالات. لقد نجح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعترف إسهامات جوليتش ​​Dörthe ، الجولة جنيفر وأندرو مارا في تطوير هذا البروتوكول. دعم البحوث المقدمة من معاهد الصحة القومية ، والجمعية الأميركية للسرطان ، ومارس من الدايمات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول بارافورمالدهيد 16%، درجة EMElectron Microscopy Sciences15710يُخفف إلى 4% في PBS بتركيز 1.33x (التركيز النهائي 1x). يُحفظ في حصص مقدار 2ml عند –20°C
بروتينيز K، درجة PCR مأشوبةRoche Group03115879001يُحضّر محلول مخزون بتركيز 20mg/ml في الماء. يُحفظ في حصص مقدار 1ml عند –20°C
كاشف حجب (Blocking Reagent)Roche Group11096176001يُحضّر محلول مخزون بتركيز 10% في محلول حمض الماليك المنظم بتركيز 1x. يُحفظ في حصص مقدار 50ml عند –20°C. مستقر عبر عدة دورات من التجميد والإذابة.
Anti-Fluorescein-POD، قطع FabRoche Group11426346910تُقسم إلى حصص وتُحفظ عند -20°C. تُحفظ حصة واحدة للعمل عند 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD، قطع FabRoche Group11207739910كما ورد أعلاه.
نظام TSA Plus FluoresceinPerkinElmer, Inc.NEL741001KTتُحضّر كل قارورة من كاشف TSA عند الحاجة فقط. تُذاب في 60μl DMSO. تُحفظ عند 4°C.
نظام TSA Plus Cyanine5PerkinElmer, Inc.NEL745001KTكما ورد أعلاه
نظام TSA Plus Cyanine3PerkinElmer, Inc.NEL744001KTكما ورد أعلاه
طقم TSA رقم 16 تيراميد AlexaFluor647 (بالإضافة إلى HRP-goat-anti-rabbit IgG)Molecular Probes, Life TechnologiesT20926يُذاب كاشف التيراميد في 150μl DMSO، ثم يُقسم إلى حصص ويُحفظ عند –20°C.
خالٍ من RNase وDNaseRoche Group11119915001مُوفر كمحلول بتركيز 500μg/ml
يوديد البروبيديوم (Propidium Iodide)Molecular Probes, Life TechnologiesP-3566مُوفر كمحلول بتركيز 1mg/ml في الماء.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
  3. Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  4. Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
  5. Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة