العزلة ذات جودة عالية ، RNA سليمة هو خطوة أساسية في بروتوكولات مختبر كثيرة. هنا ، علينا أن نظهر استخراج الحمض النووي الريبي من الأجنة الزرد كله والتوليف [كدنا] لاحقة في تطبيق إجراءات التجريبية المختلفة بما في ذلك التعبير الجيني التحليل ميكروأري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العديد من الإجراءات المختبرية هامة ومعقدة تتطلب مدخلات عالية من الحمض النووي الريبي ، ونوعية سليمة. ويمكن لعينة المتدهورة أو وجود شوائب تؤدي إلى نتائج كارثية في مجال التطبيقات التجريبية المصب. ومن ثم فهي ذات أهمية قصوى لاستخدام تقنيات متينة مع العديد من الضمانات والضوابط لمراقبة الجودة لضمان عينة متفوقة. هنا ، نحن من التفصيل على بروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي من مجموع الأجنة الزرد بأكملها باستخدام ممسخ الكيميائية المتاحة تجاريا وتنظيف لاحقة لإزالة آثار الحمض النووي والشوائب باستخدام الحمض النووي الريبي عزلة تجارية عدة. كما RNA غير مستقر نسبيا ، وعرضة للانقسام بسهولة بواسطة RNAses ، ومعظم البروتوكولات التعبير الجيني فحص باستخدام المنتج الذي يتم تصنيعه [كدنا] مباشرة من قالب الحمض النووي الريبي. نحن من التفصيل إجراء لتحويل الحمض النووي الريبي في الناتج [كدنا] أكثر استقرارا استخدام عدة متاحة تجاريا. طوال هذه الإجراءات هناك العديد من الضوابط لمراقبة الجودة لضمان أن العينة ليست متدهورة أو ملوثة. المنتج النهائي من هذه البروتوكولات هو [كدنا] التي هي مناسبة لتحليل ميكروأري ، RT PCR أو تخزين طويل الأجل.
البروتوكول
الجزء 1 : استخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الكاشف TRIzol
عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي من المهم جدا للعمل في بيئة خالية من RNAses. احتياطات بسيطة مثل وجود ماصات محفوظة للاستخدام فقط مع الإجراءات RNA والرش في منطقة عمل مع كاشف المطهر (على سبيل المثال ، ريبونوكلياز ذهاب) قبل بداية الإجراء هي مفيدة جدا.
- للوصول الى كمية كافية من الحمض النووي الريبي تجمع الأجنة الزرد 50 مل في أنبوب microfuge 1.5 وإزالة المياه وأكبر قدر ممكن مع ماصة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هشاشة جزيء الحمض النووي الريبي هو الاعتبار الأهم الذي ينبغي ألا يغيب عن البال طوال هذا البروتوكول. وينبغي دائما أن المعدات المعقمة ريبونوكلياز خالية تستخدم في منطقة خالية من ريبونوكلياز المختبر. ومن المفيد أن تحتفظ بجزء من المختبر لاستخدامها في إجراءات RNA فقط. يجب رش هذا المجال في كثير من الأحيان مع منتج ريبونوكلياز إزالة مثل ريبونوكلياز بعيدا. وينبغي دائما على عينات الحمض النووي الريبي يتم التعامل معها قفازات وأبقى على الجليد لمنع تدهورها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| جليكوجين (5 mg/ml) | Ambion | 9510 | |
| جهاز NanoDrop ND-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-1000 | |
| مدقات سحق مع أنابيب طرد مركزي دقيقة | VWR international | KT749520-0090 | |
| هلام Phase Lock Gel Light، 1.5 ml | Eppendorf | 2302800 | |
| فينول، مشبع بالـ Tris | Roche Group | 3117944001 | |
| منظف RNAse Away | VWR international | 17810-491 | |
| مجموعة DNase خالية من الـ RNAse | Qiagen | 79254 | |
| مجموعة RNEasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| نظام SuperScript® لتخليق الشريط الأول لـ RT-PCR | Invitrogen | 11904-018 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 |
المراجع
- TRIzol Reagent Manual. , (2007).
- RNEasy Mini Handbook. , 4th ed, (2006).
- SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Version E. (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
![عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F1470.jpg&w=3840&q=75)