نحن تقديم في المختبر ، اللونين مقايسة مضان لتصور اندماج جزيئات فيروس واحد مع طبقة ثنائية الهدف السوائل. وذلك عبر تسمية الجسيمات الفيروسية مع fluorophores أن صمة بالتفاوت في الغشاء الفيروسية وباطنها ، ونحن قادرون على رصد حركية hemifusion وتشكيل المسام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الانصهار الغشاء هو خطوة أساسية أثناء دخول الفيروسات يلفها في الخلايا. المقايسات التقليدية الانصهار التقرير عادة على عدد كبير من الأحداث الانصهار ، مما يجعل من الصعب تحليلها كميا تسلسل الخطوات الجزيئية المعنية. طورنا في المختبر ، وهما لونا مقايسة مضان لرصد حركية من جسيمات فيروس واحد الصمامات مع طبقة ثنائية الهدف على دعم السوائل أساسا.
يتم تحضين جزيئات الأنفلونزا الفيروسية مع fluorophore a الأخضر لمحبة للدهون وصمة عار في الغشاء وfluorophore ماء حمراء لصبغ الداخلية الفيروسية. نحن إيداع طبقة ثنائية الدهن غانغليوزيد المحتوية على سطح الزجاج ديكستران - functionilized خلية تدفق الجزيئات الفيروسية احتضان على طبقة ثنائية مستو وصورة مضان من 100 × 100 مساحتها 2 ميكرون ، تحتوي على عدة مئات من الجزيئات ، على اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا. بواسطة التصوير كلا من مضان أحمر وأخضر ، ويمكننا رصد سلوك واحد للصباغة غشاء (الخضراء) والمحتوى المائي (أحمر) من الجسيمات.
على خفض درجة الحموضة إلى قيمة أقل من الرقم الهيدروجيني الانصهار ، سوف تندمج مع جزيئات الغشاء. Hemifusion ، ودمج المنشور في الغشاء الخارجي الفيروسية مع النشرة الخارجي للغشاء الهدف ، وسوف تكون واضحة على أنه تغيير مفاجئ في مضان أخضر من الجسيمات. وبناء على الاندماج اللاحقة للمنشورات two القاصي المتبقية يتم تشكيل المسام ، وسوف يتم الافراج عن fluorophore الحمراء التي تنبعث منها في الجسيمات الفيروسية تحت غشاء الهدف. هذا الحدث سوف تؤدي إلى انخفاض في مضان أحمر من الجزيئات الفردية. أخيرا ، ومضان متكاملة من fluorophore الحموضة حساسة مضمن في غشاء الهدف تقارير عن الوقت المحدد لانخفاض الرقم الهيدروجيني.
من آثار مضان وقت الثلاث يمكن ، الآن كل الأحداث الهامة (انخفاض درجة الحموضة ، واختلاط الدهون على المحتوى ، وعند خلط hemifusion تشكيل مسام) يمكن استخراجها بطريقة مباشرة ومنفردة لكل جسيم. من خلال جمع العصر المنقضي لالتحولات المختلفة للكثير من الجزيئات الفردية في رسوم بيانية ، يمكننا تحديد أعمار وسيطة من المقابلة. يمكن أن تكون وسيطة حتى الخفية التي لم يكن لديك تصور يمكن ملاحظتها مباشرة الفلورسنت مباشرة من هذه المدرج الاحصائي.
البروتوكول
الزجاج functionalization تغطية زلة
يتم اعتماد طبقة ثنائية مستو المستخدمة في فحص الانصهار على فيلم رطب من ديكستران. ديكستران الأفعال كفاصل بين طبقة ثنائية ومستو سطح الزجاج. هذا يمنع من أن تصبح مكونات غشاء عالقة على سطح الزجاج ، ويوفر أيضا في الفضاء الذي محتويات جسيمات الفيروس يمكن الخروج عليها الانصهار. وfunctionalized coverslips الزجاج من خلال المعاملة مع الايبوكسي سيلاني ، والذي يسمح لنا ديكستران السندات كيميائيا على الزجاج (Elender ، وآخرون 1996).
- ترتيب covers....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويمكن إعداد السوائل والدهون طبقات ثنائية مستمرة بدعم أمرا صعبا. وكميات ضئيلة من المواد الملوثة أو عيوب السطح منع انتشار طبقات ثنائية. تنظيف دقيق وترسب طبقة موحدة من ديكستران ضرورية.
يمكن التصوير لفترة طويلة من جزيئات الفيروس التبييض التسميات الفلورسنت أو تسبب لهم أن يصبحوا المعطل. ومن المعروف جيدا الصور والضرر من هذا النوع في التصوير الحيوي ومجالات جزيء واحد ، ويعتقد عموما أن تنبع من جيل من أنواع الأكسجين التفاعل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وأيد عمل المعاهد الوطنية للصحة منح AI57159 (لSCH) وAI72346 (لAMvO). SCH هو هوارد هيوز الطبي محقق المعهد.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مربعات زجاج غطاء Corning، 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| شرائح السيليكا المنصهرة | Technical Glass | ||
| رف صبغ | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| كوليسترول | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| ستريبتاديفين، مقترن بالفلوريسين | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a مستخلص من دماغ البقر | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| جهاز بثق صغير (Mini Extruder) | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| مرشحات غشاء بولي كربونات 0.1 micron | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| أقراص تصريف 10 mm (دعامات غشاء) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| ملح الصوديوم لـ Sulforhodamine b | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | راجع Floyd et al. 2008 لمعرفة بروتوكول التخليق | ||
| أعمدة إزالة الأملاح PD-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| مجهر فلورسنت Nikon | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| عدسة شيئية Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA | Nikon Instruments | ||
| ليزر Innova 70C Spectrum Ar/Kr | Coherent Inc. | ||
| مضخة سرنجة | Harvard Apparatus | 702213 |
المراجع
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
