hemocytes ذبابة الفاكهة تفريق أكثر من مجمل الجنين النامية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تحميل الصور وهذه الهجرات استخدام الاجنة مع hemocytes fluorescently المسمى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العديد من الخلايا باستخدام عنوان دراسات الهجرة
البروتوكول
إعداد
- الحصول على خطوط المناسبة ذبابة الفاكهة التي تحتوي على كرية دموية محددة Gal4 السائق (على سبيل المثال Gal4 SRP - 2) ومراسل المرمزة وراثيا الفلورسنت تحت السيطرة UAS (على سبيل المثال ، UAS GFP). الذباب متماثلة اللواقح بالنسبة SRP - Gal4 ، UAS GMA - 3 أو crq Gal4 ، UAS GFP - 4 و 5 هي مفيدة بشكل خاص لأغراض التصوير (ملحوظة GMA هو GFP تنصهر إلى المجال أكتين الملزم moesin) ؛ أنظر أدناه للاطلاع على مناقشة مجموعة من السائقين وGal4 UAS يبني المتاحة (المخزون بلومينغتون المركز يحتوي على تشكيلة واسعة).
- وتنفذ عادة من الصلبان الوراثية بحيث تكون متوازنة الأليلات الطافرة باستخدام الفلورسنت أو موازنات CTG TTG 6 ، Gal4 مع السائقين والتي تقوم على ثوابت UAS الكروموزومات المتماثلة البديلة. هذا يجعل من الممكن لتحديد طفرات متماثل على أساس عدم وجود CTG / TTG المرتبطة GFP مضان (يتم ذلك في مرحلة 2.11).
- تضخيم الأرصدة والذباب مكان في قفص مع وضع لوحة عصير التفاح أغار 7. الذباب تحتاج على الأقل يومين للتأقلم إلى القفص قبل زرع الأجنة بما فيه الكفاية لتكون وضعت تبدأ. عموما يجب أن twenty الذباب من كل جنس تكون كافية لتوليد ما يكفي لتصوير الأجنة ولكن تجدر الإشارة إلى أن خطوط مختلفة وبدرجات متفاوتة من الخصوبة. نستخدم 55mm أطباق بتري التي تناسب في الجزء السفلي من كوب من البلاستيك ، ثقب في قاعدتها لتسمح بتدفق الهواء. وسيلة لجمع الأجنة بالضبط هو غير مهم ، ولكن توقيت حاسمة من أجل جمع صحيح نظموا الأجنة.
- جمع الأجنة لوحة من التفاح بين عشية وضحاها آغار عصير المحافظة على درجة حرارة 25 مئوية أو من لوحة التوقيت. لهذا الاخير نسمح عادة لوضع الذباب على طبق من قبل استعد لمدة 4 ساعات ، قبل إزالة لوحة ووضعها على 18 درجة مئوية ل15-16 ساعة قبل المتصاعدة من الأجنة ، وهذا يوفر أجنة من 12 وحتى مرحلة متأخرة إلى المرحلة 15 من التنمية. بين عشية وضحاها لوحة تحتوي على تنوع أكبر من المراحل ولكنها تقدم في الاستفادة من أعلى مستويات التعبير مراسل الفلورية في hemocytes نتيجة لفترة أطول من الزمن عند 25 درجة مئوية كنظام Gal4 - UAS حساس درجة الحرارة.
إجراء
- طرد من الأجنة لوحة عصير التفاح أغار باستخدام كمية صغيرة من الماء والفرشاة الناعمة ذات الرؤوس. ويمكن رؤية الأجنة فكها بسهولة بالعين المجردة.
- نقل الأجنة لمصفاة الخلية (فيشر) أو محلية الصنع. سلة 7 بصب الماء من لوحة عصير التفاح أغار داخل السلة التي جرت خلال دورق المياه لجمع النفايات
- كرر الخطوة حتى 2،2 كنت راضيا لديك ما يكفي من الأجنة المنقولة من التفاح طبق آغار العصير.
- غسل الأجنة في الخلية مصفاة / سلة باستخدام المياه.
- خلية مكان مصفاة / سلة في غطاء صحن بيتري لوحة عصير التفاح آغار وإضافة مواد التبييض أنيق يكفي لوقف الأجنة في الخلية مصفاة / سلة.
- اتبع dechorionation للأجنة على تشريح تحت المجهر brightfield : dechorionation اكتمال عندما يكون حل لواحق الظهرية ، والتي يجب أن تحدث في غضون دقيقتين.
- إزالة الخلايا مصفاة / سلة تحتوي على أجنة من مبيض ويغسل التبييض باستخدام المياه المتبقية. يجب إزالة جميع آثار التبييض قبل الشروع في خطوة 2.8. خدعة واحدة لتقييم ما إذا كان قد تم إزالة جميع التبييض هو وصمة عار قبالة المياه المتبقية على أنسجة مختبر زرقاء اللون -- إذا كان هناك التبييض المتبقية سيتم ابيض اللون الأزرق والأبيض / الوردي.
- وصمة عار قبالة المياه المتبقية باستخدام الأنسجة المختبرية / mediwipes تطبيقها على الجانب السفلي للخلية مصفاة / سلة.
- وضع قطرات من الماء في غطاء طبق بيتري. مع الفرشاة الجميلة ، وجمع كل من الأجنة dechorionated سلة الجنين وresuspend لهم في الحبرية. الجافة القادمة من الأجنة الشفط باستخدام المياه أو استيعاب micropipette بعناية بمنديل مختبر / mediwipes.
- بمجرد المجففة الأجنة ، إضافة قطرة من النفط لتغطية جميع voltalef الأجنة. وضع ثاني انخفاض صغير للنفط بالقرب من قطرات تحتوي على الأجنة. ملاحظة : لم نستطع العثور على مورد ومقرها المملكة المتحدة من النفط voltalef ، ويمكن استخدام الزيت الهالوكربون 700 (سيغما) بدلا من ذلك.
- تحت المجهر الفلورسنت حدد تشريح قام مناسب من الأجنة الوراثي المطلوب باستخدام زوج من الساعات ملقط (رقم 5) من قطرات النفط. وينبغي أن تكون هذه ملقط عازمة الداخل (الشكل 1) في لتلقط الأجنة دون ثقب الغشاء المحي بهم. نقل الأجنة لاختيار الحبرية النفطية الثانية. فمن المهم أن تكون قادرا على رؤية hemocytes الفلورسنت على مجهر تشريح لكي تكون قادرة على جمع صور جيدة على المجهر مبائر (الشكل 2). نحن عادة ما يشن الأجنة مرحلة 13/14 إلى الهجرة الصورة الجانبية لhemocytes على خط الوسط بطني أو مرحلة الأجنة 15لصورة حركية من تشتت hemocytes التالية على الجنين.
- عصا two coverslips (18x18mm ، وسمك 1) إلى الجانب السفلي من صحن Petriperm / Lumox (Sarstedt) ، وذلك باستخدام 2 قطرات صغيرة من النفط voltalef ، وترك ما يقرب من 1cm بينهما (الشكل 3) ، وسيتم استخدام هذه ساترة لدعم وضعها فوق الأجنة ، بحيث لا سحقهم. أطباق Petriperm (القطر 50mm) تحتوي على ماء والغاز نفاذية الغشاء. نجد أن الأطباق تصبح أسهل للاستخدام مرة واحدة استخدمت فيها عدة مرات (يمكن أن تمحى الأطباق الايثانول مع 70 ٪ وإعادة استخدامها).
- تحت المجهر brightfield على التشريح ، والتقاط الأجنة المختارة واحدا تلو الآخر مع ملقط وعازمة خط لهم الجانب بطني حتى وموازية للحافة coverslips (الشكل 3) فمن الممكن أن تصل إلى 15 محاذاة أجنة بهذه الطريقة ، اعتمادا على مهارة وصبر الخاص بك. من المهم لمعالجة الأجنة بلطف لأن كلا من الأجنة وPetriperm غشاء طبق هشة ويمكن أن تمزق بسهولة.
- حالما يتم محاذاة الأجنة إضافة قطرة صغيرة من النفط والسماح لها انتشار لتشكيل طبقة متجانسة بين coverslips اثنين. بعد النفط وانتشر (وهذا قد يستغرق بضع دقائق) تأكد من أن الأجنة لا تزال تصل الجانب البطني. إذا كانت الأجنة قد تدحرجت قليلا ، وإعادة إليها مرة أخرى مع ملقط.
- أخيرا ، وذلك باستخدام الملقط (رقم 3) وضع ساترة (18x18mm ، وسمك 1) على الأجنة ، ويستريح على coverslips two انضمت سابقا. هذا الغراء ساترة لساترة يدعم استخدام طلاء الأظافر (الشكل 3).
- تأخذ طبق Petriperm مع أجنة لنصرة المجهر مبائر أو واسعة في الميدان وتركيب الطبق Petriperm على المسرح باستخدام المحول المناسب. قد تكون إما استخدام مجهر تستقيم أو المقلوب ، مع التركيز عدسة الهدف من خلال ساترة (على العكس من خلال الغشاء).
ممثل النتيجة :
هذا البروتوكول توضح كيفية تحميل أجنة ذبابة الفاكهة للتصوير حي لhemocytes على الجانب البطني للجنين. إذا فعلت بشكل صحيح وسوف يكون من السهل على توليد اما اللقطات أو الأفلام من hemocytes. المحدد الرئيسي هو الاداة المستخدمة لصورة hemocytes (ولا سيما في عدسة الهدف) ، ولكن طبيعة هذه الصور حصلت سيعتمد أيضا على مرحلة من مراحل التنمية ، ودرجة الحرارة أثيرت في الأجنة واستخدام خطوط Gal4 وUAS.
وارتفاع مستويات بروتين تعبير الفلورسنت تمكن من تصوير hemocytes بسهولة أكبر ، وبالتالي فإنه من المهم أن تكون قادرا على رؤية hemocytes عند الأجنة في مرحلة 2،11 البروتوكول (الشكل 2 على أمثلة واضحة داخل hemocytes الأجنة ، مع أخذ تركيب الكاميرا إلى مجهر تشريح). أعداد متزايدة من Gal4 وبالتالي يبني UAS تمكين أكبر إشارة إلى نسبة الضوضاء. وعلاوة على هذا يقلل من الحاجة لشدة الليزر عالية أو زيادة التعرض مرات الواجب اتباعها عند التصوير ، والتي بدورها تمكن السلوك كرية دموية لفترات أطول من الوقت.
ومستويات عالية جدا من التعبير GFP تظهر التفاصيل الدقيقة من التشكل كرية دموية ، لا سيما ورقة رقيقة مثل صفاحات التي تحيط خلايا الجسم دائري الشكل (4A - B). مناطق دائرية باستثناء GFP تمثل phagosomes (الشكل 4A - C). ويمكن أيضا توجيه أصابع أرجل كاذبة خيطية أن ينظر إلى مثل الناشئة عن صفاحات (الشكل 4B). اثنين من السائقين Gal4 تبقى كافية لرؤية هذه العمليات (الشكل 4C) ، لا سيما إذا واحد أو أكثر من SRP - Gal4 (انظر المناقشة) ، ولكن قد تكون هناك حاجة بسرعة أبطأ المسح أو أكبر قوة الليزر على المجهر مبائر. وانخفاض مستويات التعبير يصبح أكثر صعوبة في صورة نتوءات من hemocytes ، ومع ذلك لا يزال من الممكن لتتبع هجرة hemocytes في ظل هذه الظروف كما لا يزال خلية في الجسم واضحة حتى عند نتوءات أقل وضوحا (الشكل 4D).
في المراحل المبكرة من التنمية (تصل إلى مرحلة 13) hemocytes ترحيل على اتصال وثيق مع بعضها البعض وغالبا ما يكون من الصعب تمييز الخلايا الفردية. في نهاية المرحلة 13 hemocytes شكلت خط واحد أسفل بطني خط الوسط (الشكل 5A) ، ثم ، لتصبح أكثر متحركة ، ترحيل أفقيا على حواف من الحبل البطني العصب (الشكل 5B). يمكن أن يكون الهيكل الخلوي أكتين داخل نتوءات دينامية hemocytes وحظ مباشرة من خلال التعبير عن GMA (الشكل 5C) أو الكرز moesin.
تصاعد الأجنة في هذه الطريقة تتيح تبادل الغازات ويمنع الجفاف والأجنة لا تزال قابلة للحياة بعد التصوير. في حالة تلف الجنين أثناء تصاعد فمن الواضح عموما كمحتوى الجنين وتسرب من خلال الغشاء المحي والخمسين. يمكن إذا كان الجنين لم يبدأ بعد ذلك في كثير من الأحيان يذوى كانت هذه التشوهات التي اطلعت عليها في الغشاء المحي. أحيانا الجنين سوف لفة خلال فيلم timelapse ، ولكن هذا فقط يميل إلى أن يكون مشكلة بالنسبة للأفلام الطويلة الزمني. Lastlذ ، تصاعد أجنة عدة في آن واحد يعطي التجريبي أفضل فرصة للحصول على الجنين في التوجه المثالي لتجربتهم.
الشكل 1. ملقط للتلاعب dechorionated الأجنة.
ينبغي للنصائح من الساعات ملقط (رقم حجم 5) تكون عازمة في الداخل من أجل أزياء أداة لحلج القطن حتى الأجنة كما هو موضح هنا. على السطح الخارجي للمنطقة عازمة مفيد أيضا لمعالجة الأجنة عند وضع على الغشاء Petriperm لأنها لا تملك الحواف الحادة التي يمكن أن ثقب الجنين.
الشكل 2. ممثل صور للأجنة التي من شأنها أن تحقق نتائج جيدة التصوير مباشرة.
صور لأجنة في dechorionated voltalef النفط (2،11 في مرحلة من البروتوكول) المتخذة بشأن تشريح المجهر الفلورسنت. الوحشي آراء المرحلة 13 (A) ومرحلة 15 (B) SRP - Gal4 ، UAS - GFP ؛ crq - Gal4 ، UAS - GFP الأجنة. عرض الوحشي لمرحلة 15 - SRP Gal4 ، UAS GFP - / + ؛ crq - Gal4 ، uas-GFP/uas-N17Rac الجنين (C) والتي فشلت hemocytes لترحيل من الرأس ، مما يدل على ما يبدو عند الأجنة hemocytes ليست واضحة على طول مسارات هجرتها. عرض الوحشي لمرحلة 17 - SRP Gal4 ، UAS - GFP ؛ الجنين UAS - GFP crq - Gal4 ، والتي تبين هيكل معقد للامعاء في هذه المرحلة من التنمية (D) ، وبداية انقباض العضلات يمنع التصوير حية من وراء هذه الأجنة مرحلة من مراحل التنمية. آراء بطني من المرحلة 13 (E) ومرحلة 14 (F) SRP - Gal4 ، UAS الحمراء الأجنة الحشرة تظهر تشتت hemocytes بنواة fluorescently المسمى. ملاحظة hemocytes بواسطة مضان 2.11 في مرحلة من البروتوكول هو شرط أساسي للحصول على صور ممتازة ؛ الأمامي هو الحق لجميع الصور.
الشكل 3. تصاعد الأجنة على طبق Petriperm / Lumox.
عالقون اثنين coverslips 18x18mm (سمك 1) على الوجه السفلي من صحن Petriperm باستخدام قطرة صغيرة من النفط ، ومفصولة عن 1cm كما هو مبين. تصطف الأجنة ثم يصل الجانب البطني مع موازية لها محور طويل (الأمامي الخلفي) لحواف coverslips ومغطاة قطرة صغيرة من النفط. مرة واحدة وانتشر النفط لملء الفجوة بين الاثنين هو وضع coverslips بلطف ساترة الثالثة (18x18mm سمك 1) على رأس الأجنة النفط المغطاة باستخدام coverslips two انضمت سابقا بمثابة جسر لمنع الأجنة من أن ممرود. ومن ثم لصقها ساترة لهذه الجسور ساترة اثنين باستخدام نقطتين صغيرة من طلاء الأظافر. مجموعة مرة واحدة ، ويمكن تصوير الأجنة على مجهر مقلوب أو تستقيم مع الهدف عدسة التركيز باستمرار من خلال ساترة (على العكس من خلال الغشاء Petriperm).
الشكل 4. ممثل النتائج من التصوير المباشر للhemocytes GFP المسمى.
Z - إسقاطات hemocytes على الجانب البطني لمرحلة 14 - SRP Gal4 ، UAS - GFP ؛ crq - Gal4 ، UAS - GFP الجنين (AB). (A) هي صورة انخفاض التكبير مثل استخدامها لرصد الهجرات التنموية كرية دموية في الأفلام timelapse. (ب) هو أعلى التكبير لا يزال hemocytes على خط الوسط بطني ، والتي تبين التفاصيل الدقيقة لمورفولوجيا بهم. (C) هو واحد من شريحة م 1 hemocytes على بطني خط الوسط في مرحلة 14 - SRP Gal4 ، UAS GFP - / + ؛ crq - Gal4 ، UAS GFP - / + جنين ، وكشف عن أن أعدادا أقل نسخة من السائقين وGal4 UAS يبني أيضا كافية لتوليد صور جيدة. (د) يعرض A - Z إسقاط hemocytes في مرحلة crq 14 - Gal4 الجنين UAS - GFP. هنا نتوءات كرية دموية أقل وضوحا بسبب انخفاض التعبير عن GFP لكنه لا يزال من الممكن لجعل الأفلام ومسار الهجرة كرية دموية مع هذا المزيج من السائق وGal4 UAS بناء. أخذت الصور على المجهر LSM510 ايكا مبائر ؛ الأمامي متروك في جميع الصور ، وتسبب في حلقات على هامش الصور عن طريق الغشاء المحي تألق ذاتي.
الشكل 5. ممثل النتائج من التصوير المباشر للتعبير عن hemocytes GMA.
Z - إسقاطات hemocytes على خط الوسط بطني من المرحلة 13 (A) ومرحلة 14 (B) SRP - Gal4 ، UAS - GMA الأجنة ، وهي مأخوذة من أفلام timelapse لاظهار الهجرات hemocytes التنموية. ويمكن الحصول على معلومات مفصلة عن ديناميات أكتين بواسطة التصوير تضخم أعلى من hemocytes GMA معربا عن (C). GMA يتكون من GFP تنصهر إلى المجال أكتين ملزم من شعيرات أكتين moesin والتسميات. الأمامي متروك في جميع الصور ، واتخذت صورا على مبائر المجهر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وأهم عناصر هذا الإجراء يتم اختيار الأجنة السليمة مع hemocytes المسمى بوضوح ، ويشن منها بعناية من دون تعرضها للتلف. ولا يمكن تصوير الأجنة مرة واحدة في مجال النفط والهالوكربون أنها مقاومة للجفاف وشنت مرة واحدة لعدة ساعات. في أيدينا يمكننا hemocytes صورة لمدة ثلاث ساعات ، مع الجفاف تافهة من الجنين أو واضحة الصور الضرر ، مع الأخذ في Z - كومة من الصور كل ثلاث دقائق على المجهر لدينا LSM510 زايس مبائر مع الهدف 40X. منذ hemocytes ديناميكية للغاية قد يكون هناك مقايضة بين القرار المكانية وا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وقد تم تطوير هذا البروتوكول من خلال عملنا داخل وبالتعاون مع مختبرات بول مارتن وخاسينتو انطونيو. نشكر مركز ألبوم بلومينغتون لخدمة الممتازة والمجتمع ذبابة الفاكهة لمواصلة تبادل خطوط الطيران. وتمول حاليا من قبل BS منحة المشروع BBSRC. وتمول من قبل WW زمالة يلكوم ترست التطوير الوظيفي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مصفاة الخلايا | BD Biosciences | 352350 | 70μمسام m |
| زيت Halcarbon 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| طبق Lumox/Petriperm | شركة Sarstedt Ltd | 96077305 |
المراجع
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruckner, K. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, 73-84 (2004).
- Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34, 146-151 (2002).
- Stramer, B. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Halfon, M. S. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34, 135-138 (2002).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2000).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, 1829-1837 (1994).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, 621-626 (2008).
- Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130, 3965-3975 (2003).
- Olofsson, B., Page, D. T. Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity. Dev Biol. 279, 233-243 (2005).
- Paladi, M., Tepass, U. Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila. J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).
- Vlisidou, I. Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time. PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).
- Jacinto, A. Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure. Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).
- Wood, W., Jacinto, A. Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos. Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).
- Kunwar, P. S. Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin. J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
