مقالة منهجية

إعداد Oligomeric β اميلويد 1-42 والتعريفي للعاهة اللدونة متشابك على شرائح الحصين

DOI:

10.3791/1884

⸱

يوليو 14, 2010

 ,  ,  ,  ,  , 
1Taub Institute for Research on Alzheimer's Disease and Aging Brain, Columbia University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميزة واحدة لمرض الزهايمر هو ارتفاع Aβ 1-42 الببتيد. هنا نقدم مشروع بروتوكول لإعداد Aβ الاصطناعية 1-42 oligomers ، الذي ينال الحصين بعيدة المدى ، وهي ربط الخلوي للذاكرة. هذا الإجراء مفيدا للتحقيق في آليات فحص الأمراض والمخدرات التي يسببها Aβ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ضعف الاتصالات متشابك من المحتمل أن تكمن وراء التغييرات الطفيفة التي تحدث في نساوي المراحل المبكرة من مرض الزهايمر ق (AD). ومن المعروف β اميلويد (Aβ) ، الببتيد التي تنتج في كميات عالية في ميلادي ، للحد بعيدة المدى (الكمونية) ، وهي الخلوية ربط التعلم والذاكرة. في الواقع ، بسبب ضعف LTP Aβ هو نموذج تجريبي لدراسة مفيدة متشابك اختلالات في النماذج ميلادي والفرز على المخدرات قادرة على التخفيف من العاهات أو العودة متشابك من هذا القبيل. وقد أظهرت الدراسات التي تنتج Aβ تعطل LTP تفضيلي عبر شكله oligomeric. هنا نقدم بروتوكول مفصلة للعرقلة من قبل LTP نضح الاصطناعية oligomerized Aβ1 - 42 على شرائح الببتيد الحصين الحادة. في هذا الفيديو ، ونحن المخطط إجراء خطوة بخطوة لإعداد Aβ oligomeric

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعادة التعليق β اميلويد ببتيد

لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :

  • Aβ 1-42 (مسحوق مجفف بالتجميد)
  • 1،1،1،3،3،3 - Hexafluoro - 2 - بروبانول (HFIP)
  • منخفضة ملزم أنابيب البولي بروبلين microcentrifuge (1.5 مل)
  • GasTight هاميلتون المحاقن مع وقف الهبوط تفلون (250 ميكرولتر)
  • Dimethylsulfoxide (DMSO)
  1. تسمح Aβ مجفد 1-42 لكي تتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتجنب التكثيف عند فتح القارورة الببتيد.
  2. تحت غطاء الدخان ، وإعادة تعليق Aβ 1-42 الببتيد في HFIP الجليد الباردة للحصول على حل من 1 ملم ودوامة الحل لبضع ثوان.
  3. باستخدام محقنة زجاجية هاميلتون GasTight مع المكونات تفلون ، تقسيم بسرعة Aβ 1-42 / HFIP حل بالتساوي في قوارير البولي بروبلين الثلاث وختم القوارير.
  4. ثم يتم تحضين قارورة لمدة 2 ساعة للسماح للmonomerization Aβ. المقبل ، فتح قنينة والتركيز على حل Aβ 1-42 / HFIP ظل فراغ باستخدام جهاز للطرد المركزي SpeedVac (800 غرام ، درجة حرارة الغرفة) وحتى لوحظ الفيلم الببتيد واضحة في الجزء السفلي من قنينة. الاختيار بعناية درجة الحرارة داخل أجهزة الطرد المركزي لتجنب تدهور SpeedVac الببتيد (حد أقصى 25 درجة مئوية).
  5. ختم القنينات وتخزين aliquots في -80 درجة مئوية. ويمكن تخزين فيلم Aβ لمدة 6 أشهر.
  6. اعادة تعليق فيلم واحد عن طريق إضافة DMSO للحصول على تركيز تصل إلى 5 ملي Aβ 1-42. يصوتن في حمام مائي لمدة 10 دقيقة كاملة لضمان اعادة التعليق.
  7. قسامة هذا Aβ 5mM 1-42 حل في قوارير البولي بروبلين. ختم كل قارورة وتخزينها في -20 درجة مئوية. يجب إذابة Aliquots مرة واحدة فقط. حذار من تكثيف الماء داخل الثلاجة. الببتيدات في حل تتحلل بسهولة بالغة.

Oligomerization

لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :

  • Aβ 1-42 / DMSO (5mM)
  • الفوسفات العقيمة العازلة
  • منخفضة ملزم أنابيب البولي بروبلين microcentrifuge (1.5 مل)
  • منخفضة ملزم أنابيب البولي بروبلين الطرد المركزي (50 مل)
  1. تمييع Aβ الحصول 5mM 1-42 / DMSO قسامة مع العازلة الفوسفات العقيمة (تصل إلى 100 ​​ميكرولتر).
  2. دوامة لمدة 30 ثانية ثم احتضان لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية

الحصين شريحة العلاج

عند معالجة شرائح الحصين ، فمن المهم لتجنب التصاق غير محددة الببتيد على الأكواب ، والأسطح أنابيب التروية ، وغرفة تسجيل. استخدام تفضيلي منخفض ملزمة أنابيب البولي بروبيلين والحاويات. تجنب استخدام الأواني الزجاجية أو البلاستيكية عامة وير. وينبغي أن تكون وسائل الاعلام نضح المصل أو الزلال الحرة.

Aβ نضح

لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :

  • Oligomerized Aβ 1-42
  • تسجيل العازلة (مم : 124 كلوريد الصوديوم ، 4.4 بوكل ، 1 نا 2 هبو 4 ، 25 NaHCO 3 ، 2 CaCl 2 ، 2 MgCl 2 ، والجلوكوز 10)
  • الكهربية تسجيل انشاء غرفة مع واجهة
  • الحصين شرائح عرضية المحتضنة في المخزن المؤقت لتسجيل الاوكسيجين 90 دقيقة على الأقل في مرحلة ما بعد تشريح (T = 29 درجة مئوية ، معدل ثابت نضح = 2 مل / دقيقة)
  1. على الفور قبل التجربة ، وتمييع Aβ oligomerized 1-42 قسامة لتركيز العمل المناسبة (200 نيوتن متر أو أعلى) في أنبوب البولي بروبلين العازلة مع تسجيل قبل الاوكسيجين.
  2. ويروي Aβ 1-42 حل لمدة 20 دقيقة لشرائح قبل تحريض اللدونة متشابك.

تحريض اللدونة والمتابعة

  1. عادة ، النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من المرونة متشابك هو الكمونية. يمكن أن يتسبب ذلك من خلال تحفيز كزازي من المشبك معينة في قرن آمون. نسجل الردود الحقل من نقاط الاشتباك العصبي بين التوقعات والضمانات شافير والخلايا العصبية CA1 الهرمية في الطبقة المشععة. التحفيز لدينا كزازي يتكون من تحفيز انفجار ثيتا التي تضم 3 قطارات مفصولة فترات 15 ثانية. كل قطار يتكون من 10 طلقات نارية عند 5 هرتز حيث انفجر يستتبع كل 5 نبضات عند 100 هرتز. تطبيق التحفيز كزازي مباشرة بعد انتهائه ، نضح من Aβ oligomerized.
  2. مباشرة بعد التحفيز كزازي التبديل إلى نضح مع تسجيل عازلة طبيعية. الحفاظ على معدل ثابت التروية ، وتسجيل درجة حرارة الغرفة والأوكسجين المناسبة طوال فترة التجربة.

ممثل النتائج والمشاكل المحتملة

وAβ oligomerized وفقا لبروتوكول الكلاسيكية ستاين وآخرون كول 1 ، يولد مونومرات Aβ ومجموعة متنوعة من oligomers من أحجام مختلفةق (ديمر ، ترايمر ، الخ) ونضح من oligomerized Aβ 1-42 يؤدي إلى تناقص في LTP Aβ شرائح المعالجة مقارنة مع شرائح السيطرة. تحت ظروف تجريبية لدينا ، حيث يتم استخدام 3-5 الشهر القديمة C57BL/6J الفئران الذكور ، الكمونية في 200 نانومتر Aβ شرائح المعالجة على 150 ٪ من متوسط ​​القيم الأساسية في ساعتين بعد التحفيز كزازي ، في حين أن شرائح تحكم القيم والكمونية على ٪ متوسط ​​baseline2 200-250. في بعض الحالات ، قد تفشل المعاملة مع Aβ للحد من الكمونية الحصين. أخطاء فادحة عدة التي قد تحدث تشمل الفيلم المفرطة أثناء التجفيف وتركيز Aβ oligomerization غير مكتملة. قد نضح في Aβ شرائح الحصين تكون مصدرا آخر للقلق بسبب الخصائص الفيزيائية للالببتيد Aβ في الحل ، الذي هو عرضة للالتصاق غير محددة للمواد البلاستيكية. وتناقش هذه القضايا من المشاكل أدناه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على النحو الموصوف أعلاه ، قد تحدث مشاكل عدة في إعداد Aβ oligomeric النتيجة في LTP ايتأثر. طريقة واحدة لتقييم ما إذا كان تدهور Aβ أو عدم وجود oligomerization Aβ قد حدث هو تقييم إعداد Aβ باستخدام TRIS - Tricine PAGE / تحليل الغربية التنشيف والتحليلية تنبيذ فائق (وليس وصفها في هذا البروتوكول). عندما يتم إعداد نماذج الغربية في ظل ظروف non-denaturing/non-reducing التنشيف ، وينبغي أن الإعداد الناجح إنشاء التوقيع الغربية التنشيف يضم عصابات المقابلة لمونومرات وoligomers مختلفة 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها IACUC جامعة كولومبيا.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) (NS049442).>

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Aβ 1-42 (مجفف بالتجميد)American Peptide62-0-80
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)Fluka52517
Dimethylsulfoxide (DMSO)Biotium, Inc.90082
أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين سعة 50mLCorning05-538-67
أنابيب دقيقة 1.5ml MaxyClear لاستعادة قصوى للعيناتAxygen ScientificMCT-150-L-C
محلول ملحي منظم بالفوسفات pH 7.4Invitrogen10010-023
محاقن GASTIGHT سعة 250 μLHamilton Co1725
جهاز تنظيف بالموجات فوق الصوتية (حمام سونيكاتور)Branson3510
نظام تركيز Savant SpeedVacVariousSC 110A

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
  2. Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
  3. Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
  4. Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
  5. Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
  6. Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
  7. Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
  8. Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
  9. Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
  10. Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
  11. Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

1 42 HFIP DMSO

مقالات ذات صلة