تركيب أدمغة ذبابة الفاكهة البالغة: طريقة لإعداد الشرائح للتصوير متحد البؤر

هذا البروتوكول هو مقتطف من Kelly et al. ، تشريح وتلوين الفلورسنت المناعي لجسم الفطر والخلايا العصبية المستقبلة للضوء في أدمغة ذبابة الفاكهة السوداء البالغة ، J. Vis. Exp. (2017).

1. تركيب أدمغة البالغين D. melanogaster على شرائح المجهر والتصوير

1. قم ببناء شريحة "جسر". ضع غطاءين "أساسيين" على بعد 1 سم تقريبا على شريحة موجبة الشحنة. تأكد من أن الجانب المشحون إيجابيا من الشريحة متجها لأعلى. قم بلصق الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر كما هو موضح في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 1أ. عادة ما يكون من المفيد إغلاق الحواف الخارجية الثلاثة لكل زلة غطاء قاعدة بطلاء الأظافر لضمان عدم فصيل وسائط التثبيت تحت زلات غطاء القاعدة هذه. اترك طلاء الأظافر يجف تماما (10-15 دقيقة) قبل المتابعة.
2. ضع الشريحة أسفل المجهر المجسم وقم بتثبيت محلول وسائط التثبيت الذي يحتوي على الأدمغة المقطوعة في الفراغ بين الغطاء. لتوفير المزيد من التباين ، من المفيد مناورة الأضواء المنحنية بحيث تكون موازية مع سطح المقعد.
3. قم بإزالة وسائط التثبيت الإضافية من الشريحة باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم سحب الأدمغة من الشريحة.
قم بإزالة
4. وسائط التركيب الإضافية. سيسمح ذلك بوضع الأدمغة بشكل أكثر دقة خلال الخطوة التالية.
5. باستخدام زوج من الملقط والمجهر المجسم ، ضع الأدمغة على الشريحة في نمط شبكي مع مواجهة فصوص الهوائيات لأعلى.
6. ضع زلة غطاء ("الجسر") فوق الأدمغة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ). استخدم طلاء الأظافر لإغلاق جوانب زلة غطاء الجسر حيث تتلامس مع زلات غطاء "القاعدة".
7. باستخدام ماصة p200، املأ التجويف المركزي أسفل الجسر ببطء بوسائط تركيب جديدة (<فئة قوية="xfig">الشكل 1ب). ضع قطرة واحدة في كل مرة على الحافة المفتوحة لشريحة الغطاء المركزية واترك وسائط التثبيت تمتد أسفل غطاء الجسر المركزي. استمر حتى يمتلئ التجويف بالكامل بوسائط التثبيت ، ثم أغلق الجزء العلوي والسفلي بطلاء أظافر شفاف.
8. بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، قم بتصوير الشرائح على الفور أو قم بتخزينها في صندوق منزلق محكم مقاوم للضوء عند -20 درجة مئوية.
9. في غضون أسبوع واحد ، صور الأدمغة باستخدام مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر مع ليزر الإثارة ومكعبات الترشيح المناسبة للأجسام المضادة الثانوية الفلورية المختارة. عادة ما يتم الحصول على صور Z-stack للخلايا العصبية لجسم الفطر باستخدام أهداف 20X أو 40X. قد يتطلب تصوير الخلايا العصبية المستقبلة للضوء في الشبكية تكبيرا أعلى.

p class = "jove_content" >
الشكل 1: تركيب الأدمغة استعدادا للتصوير المناعي. (أ) يتم تثبيت الأدمغة على شرائح SuperFrost Plus بغطاء جسر لمنع تسطيح الدماغ. يتم لصق منزلتين من الغطاء "الأساسي" على شريحة Superfrost Plus مشحونة إيجابيا مع طلاء أظافر شفاف ثم يتم وضع أدمغة مشرحة على الشريحة بينهما. يتم وضع زلة غطاء "الجسر" الواضحة فوق الأدمغة ويتم إلتصاقها بزلات غطاء القاعدة. (ب) بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، يتم سحب Vectashield ببطء تحت الجسر للحفاظ على مضان الجسم المضاد الثانوي. ثم يتم استخدام طلاء الأظافر الشفاف لإغلاق الجزء العلوي والسفلي من زلة غطاء "الجسر". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.