$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
هذا البروتوكول مقتطف من Zhang et al ، The C. ايليجانس الأمعاء كنموذج لتكوين التجويف بين الخلايا والتكوين الحيوي للغشاء المستقطب في الجسم الحي على مستوى الخلية الواحدة: وضع العلامات عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة ، تحليل فقدان وظيفة RNAi والتصوير ، J. Vis. Exp. (2017).
< p class = "jove_title" >
تلطيخ الأجسام المضادة للأمعاء C. ايليجانس
- تثبيت
- خذ شريحة زجاجية نظيفة واستخدم بولي إل ليسين لتوليد طبقة رقيقة للديدان لتلتتصق بها. ضع 30 ميكرولتر 0.1-0.2٪ بولي إل ليسين على الشريحة وضع شريحة ثانية على قطرة بولي إل ليسين لعمل "شطيرة". ثم افركي الشرائح برفق عدة مرات لترطيب الأسطح بالكامل واتركها تجف في الهواء لمدة 30 دقيقة. قم بتسمية الجانب المصنفر من الشرائح بالقلم الرصاص.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: 0.2٪ من كميات بولي L-lysine من 200 ميكرولتر تم إجراؤها عن طريق إذابة المسحوق في dH2O ؛ يمكن تخزين هذا عند -20 درجة مئوية. استخدم الوزن الجزيئي العالي بولي إل ليسين لتحسين الالتصاق بالديدان. تركيز بولي L-يسين أمر بالغ الأهمية أيضا. لن تسمح التركيزات المنخفضة جدا للديدان بالالتصاق ولكن التركيزات العالية جدا قد تولد إشارة خلفية فلورية. قد يتحلل الفيلم السميك جدا بالكامل.
- ضع كتلة معدنية مسطحة بإحكام في قاع الحاوية (مثل حاوية البوليسترين) مملوءة بالنيتروجين السائل.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن للمرء استخدام الثلج الجاف بدلا من ذلك ، لكن النيتروجين السائل يحافظ على كتلة معدنية أكثر ثباتا في قاع الحاوية ويبرد جيدا.
- اجمع الديدان إما عن طريق غسلها من أطباقها باستخدام M9 أو اختر ديدان المرحلة المختلفة (إما البيض أو ديدان المرحلة اليرقية L1 أو L2 أو L3 أو L4) في كل شريحة. عادة ، اختر ~ 100 يرقة وأجنة أو ~ 20 بالغا لكل شريحة. ضع 10 ميكرولتر من الديدان المغسولة في منتصف الشريحة أو اختر البيض / الديدان في 10 ميكرولتر M9 أو 10 ميكرولتر 1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
- استخدم ماصة لنشر أعداد كبيرة من الديدان لتجنب التكتل.
ملاحظة: المجموعات المختلطة من الديدان المغسولة ، بسبب الازدحام واختلاف سمك المراحل ، لا تلتصق جيدا وهي أقل فعالية في التجميد (انظر أدناه) ، وبالتالي فإن اختيار الديدان الخاصة بالمرحلة (أو المجموعات المتزامنة) يعطي نتائج فائقة. تلتصق اليرقات بشكل أفضل من البالغين ويمكن وضع المزيد من في كل شريحة.
- قبل قطف الديدان على الشرائح ، انقلها إلى صفيحة وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) بدون بكتيريا OP50. يمكن أن تتداخل البكتيريا الزائدة الملتصقة بالديدان أيضا مع الالتصاق. احرص على عدم جفاف الديدان.
- ضع (أسقط) برفق غطاء 22 مم × 22 مم فوق الديدان المجمعة بحيث تتدلى حوافها على جانب واحد على الأقل من الشريحة. اضغط بشكل مستقيم لأسفل برفق ولكن بقوة بإصبع أو إصبعين على الغطاء. تجنب القص الذي من شأنه أن يضر بسلامة الأنسجة.
- انقل الشريحة على الفور وبلطف إلى الكتلة المعدنية في النيتروجين السائل واتركها لمدة 5 دقائق حتى تتجمد. ثم "قم بنقر" الغطاء في حركة واحدة سريعة باستخدام الحافة المتدلية.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة بشكل حاسم وأثناء تجميد الشريحة لتحقيق "تكسير" بشرة. تنبيه: يرجى اتباع إرشادات معدات الحماية الشخصية (PPE) عند العمل بالنيتروجين السائل.
- اغمر الشرائح المتشققة بالتجميد في وعاء زجاجي مملوء بالميثانول لمدة 5 دقائق عند -20 درجة مئوية. ثم انقله إلى وعاء زجاجي مملوء بالأسيتون لمدة 5 دقائق أخرى عند -20 درجة مئوية
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب تخزين الميثانول والأسيتون في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. بعد التثبيت ، يمكن تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية
تنبيه: الميثانول والأسيتون سامان.
- قم بإزالة الشرائح من البرطمان واتركها تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.