تشريح الأمعاء الوسطى من ذبابة بالغة: طريقة لعزل الجهاز الهضمي

الملخص

المصدر: Tauc ، H. M. ، et al. عزل الخلايا الجذعية المعوية من ذبابة الفاكهة البالغة في الأمعاء الوسطى بواسطة FACS لدراسة سلوك الخلايا الجذعية أثناء الشيخوخة. J. Vis. Exp. (2014).

في هذا الفيديو ، نسلط الضوء على تشريح أمعاء ذبابة الفاكهة البالغة ومجموعة من الأمعاء الوسطى المناسبة للتفكك أحادي الخلية و FACS من أجل عزل الخلايا الجذعية المعوية.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Tauc et al. ، عزل الخلايا الجذعية المعوية من ذبابة الفاكهة البالغة في الأمعاء الوسطى بواسطة FACS لدراسة سلوك الخلايا الجذعية أثناء الشيخوخة ، J. Vis. Exp. (2014).

< class strong = "note" >ملاحظة: إذا تم استخدام هذا البروتوكول لأول مرة لعزل ISCs عن طريق فرز FAC ، فإن عناصر التحكم التالية إلزامية من أجل تعيين معلمات FACS بشكل صحيح في البداية: الخلايا المنفصلة من النوع البري (على سبيل المثال ^{w 1118}) ذبابة الفاكهة في منتصف الأحشاء بدون Sytox. الخلايا المنفصلة من النوع البري (على سبيل المثال w¹¹¹⁸) ذبابة الفاكهة الأمعاء المتوسطة مع Sytox (انظر الخطوة 3.6). الخلايا المنفصلة عن الأمعاء الوسطى ل esg-Gal4 ، خط ذبابة UAS-GFP بدون Sytox.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المحاليل والأطباق لتشريح الأمعاء

1. قم بإعداد 4-6 قوارير تحتوي كل منها على 40 ذبابة من خط ذبابة ESG-Gal4 و UAS-GFP.
2. من محلول مخزون 10x PBS ، قم بإعداد 500 مل 1x PBS (1.8 ملي مولار NaH₂PO₄ · H₂O ، 8.4 ملي Na₂HPO₄ · 2 H₂O ، 175 ملي كلوريد الصوديوم ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4).
3. قم بإعداد محلول الاغاروز بنسبة 3.5٪ في 1x PBS (3.5 جم من درجة الرحلان الكهربائي في 100 مل 1x PBS). قم بإعداد ألواح التشريح عن طريق صب هذا المحلول في أطباق بتري (قطرها 8.5 سم) لتغطية القاع. تمنع طبقة الاغاروز إتلاف أطراف الملقط أثناء إجراء التشريح. بعد أن يصلب الجل ، قم بتخزين ألواح التشريح عند 4 درجات مئوية.
4. تحضير 300 مل من 1x PBS + 1٪ BSA طازجة قبل تشريحها ووضع الزجاجة على الثلج أو عند 4 درجات مئوية.
5. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي واتركه يبرد إلى 4 درجات مئوية.
6. أشعل أطراف 2 ماصة باستور زجاجية لتنعيم الحواف.
7. نظف زوجين من الملقط وشفرة حلاقة واحدة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
8. ضع أربعة إلى ستة أنابيب لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل لجمع الأمعاء الوسطى المقطوعة على الجليد.

فئة

2. تحضير الجهاز الهضمي وتسلخ الأمعاء

الوسطى

1. قم بتخدير الذباب من قارورة واحدة (40 ذبابة) باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ على سرير ذبابة قياسي ، وقطع رأس جميع الذباب باستخدام شفرة حلاقة ونقلها إلى طبق التشريح. صب محلول بارد 1x PBS / 1٪ BSA في طبق التشريح لتغطية جل الاغاروز. سوف يطفو الذباب.
2. أمسك بطن الذبابة بزوج واحد من الملقط ، مع إمساك الصدر بالزوج الآخر من الملقط. افصل الصدر عن البطن. ستكون القناة الهضمية مرئية ومن المرجح أن تظل الأمعاء الأمامية / المحصول متصلا بالصدر.
3. أمسك القناة الهضمية واسحبها من الصدر. لفتح القناة الهضمية ، أمسك المحصول واسحب القناة الهضمية للأمام قليلا بعيدا عن البطن.
4. أمسك الطرف الخلفي للبطن بزوج واحد من الملقط وحافة البشرة الأمامية المفتوحة مع الزوج الآخر من الملقط. احرص على عدم تدمير أنسجة الأمعاء البارزة. اسحب الطرف الخلفي بعيدا لكسر البشرة واستمر في السحب للخلف برفق شديد حتى يتم سحب القناة الهضمية بالكامل من تجويف البطن. قد يتعين إزالة المحصول مسبقا إذا كان كبيرا جدا بحيث لا يتناسب مع تجويف الجسم.
5. قم بإزالة الأمعاء الأمامية والأنابيب المالبيجي والأمعاء الخلفية والمبيضين تاركين الأمعاء الوسطى العارية.
6. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، انقل مجموعة الأمعاء الوسطى المقطوعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على محلول بارد 1x PBS / 1٪ BSA واحتفظ بالأنبوب على الجليد. يجب معالجة العينات في غضون 2 ساعة.
7. بعد اكتمال تشريح دفعة كاملة ، اشطف طبق التشريح بالماء المقطر المزدوج لغسل المتبقي من الحطام. ابدأ في تشريح الدفعة التالية من الأمعاء الوسطى (كرر الخطوات 2.1-2.7). قم بتشريح أكبر عدد ممكن من الدفعات في غضون ساعتين ، ثم انتقل إلى الخطوة 3.1.

< p class = "jove_title" >3. هضم أنسجة الأمعاء لحصاد الخلايا لفرز FAC

1. قم بإزالة محلول 1x PBS / 1٪ BSA من الأمعاء الوسطى وأضف 500 ميكرولتر من محلول Trypsin-EDTA 0.5٪ إلى كل عينة.
قم
2. بتدوير الدوامة جيدا لمدة 20 ثانية واحتضان العينات عن طريق التأرجح / الدوران اللطيف عند 20 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25-30 دقيقة.
3. دوامة مرة أخرى بعد حوالي 30 دقيقة واترك أنسجة الأمعاء الوسطى السليمة تغرق في قاع الأنبوب. قم بإزالة الخلايا المعلقة بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية ملتهبة وقم بتصفيتها من خلال شبكة نايلون 35 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
4. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. وتجدر الإشارة إلى أنه عند بدء الهضم ، قد لا تكون حبيبات الخلية مرئية في البداية ولكنها ستصبح مرئية مع تقدم هضم الأنسجة.
   1. انقل محلول التربسين بعناية مرة أخرى إلى أنبوب العينة الأصلي الذي يحتوي على أنسجة الأمعاء الوسطى السليمة المتبقية. تجنب نقل عدد كبير جدا من الخلايا من الحبيبات.
   2. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 400 ميكرولتر من البارد 1x PBS / 1٪ BSA. احتفظ بأنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على الخلايا المنفصلة على الجليد وقم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحماية الخلايا من الضوء.
   3. دوامة محلول التربسين الذي يحتوي على أنسجة الأمعاء الوسطى السليمة المتبقية مرة أخرى وضع العينات على الروك لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
5. كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.4.3 حتى يتم هضم جميع أنسجة الأمعاء المتوسطة. اجمع الخلايا المنفصلة عن جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في أنبوب واحد للطرد المركزي الدقيق. قد يتطلب ذلك خطوة طرد مركزي كما في 3.4 ، حيث قد يتجاوز حجم جميع معلقات الخلايا مجتمعة 1.5 مل. حافظ على تعليق الخلية على الجليد وحماية الخلايا من الضوء.
6. قم بتدوير الخلايا المنفصلة لأسفل عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية بعناية ، مع ترك ما يقرب من 50-100 ميكرولتر من محلول 1x PBS / 1٪ BSA في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أعد تعليق الخلايا المنفصلة برفق في 800 ميكرولتر 1x PBS / 1٪ BSA الذي يحتوي على Sytox (1: 20،000).
7. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب فالكون دائري القاع سعة 5 مل عن طريق تصفية الخلايا من خلال غطاء مصفاة الخلية (شبكة نايلون 35 ميكرومتر). احتفظ دائما بعينات الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء. الخلايا جاهزة الآن للفرز.
8. ماصة 600 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي محلول لاحق في كل أنبوب طرد مركزي دقيق يتم فرز الخلايا فيه لعزل الحمض النووي الريبي اللاحق. بالنسبة للتطبيقات النهائية الأخرى ، يمكن جمع الخلايا في محلول مختلف ، على سبيل المثال في PBS المعقم.

المواد