تحليل العمر: قياس C. ايليجانس طول العمر

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Cornwell ، A. B. ، et al. طريقة مجموعة النسخ المتماثلة: نهج عالي الإنتاجية لقياس عمر Caenorhabditis elegans كميا. J. Vis. Exp.(2018).

يصف هذا الفيديو طريقة تقليدية قائمة على الألواح لقياس عمر C. ايليجانس. يقيس بروتوكول المثال عمر الديدان المعالجة بالحمض النووي الريبي.

البروتوكول

البروتوكول التالي هو مقتطف من Cornwell et al ، طريقة مجموعة النسخ المتماثلة: نهج عالي الإنتاجية لقياس Caenorhabditis elegans Lifespan كميا ، J. Vis. Exp. (2018).

< p class = "jove_title" >1. منع إنتاج النسل عن طريق إضافة 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)

1. ازرع حتى المرحلة L4 عند 20 درجة مئوية. تحقق لمعرفة ما إذا كانت المتزامنة قد تطورت إلى L4 بعد 40 ساعة تقريبا من البذر (الخطوة 2.1.7).
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: C. ايليجانس يختلف وقت النمو في درجات حرارة مختلفة ويجب اختبار معدلات نمو الطافرة التي لم يتم تحديد معدلها تجريبيا.
   1. أضف 160 ميكرولتر من 50x FUdR إلى كل صفيحة مقاس 6 سم مع L4.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: من الأهمية بمكان إضافة FUdR في مرحلة L4. للراحة ، قم بعمل 1,000 ضعف مخزون FUdR عن طريق إذابة 1 جم من FUdR إلى 10 مل H₂O. قم بتعقيم المخزون بفلتر FUdR بفلتر 0.2 ميكرومتر وحقنة 10 سم مكعب. Aliquot ~ 1 مل من المخزون في أنابيب معقمة 1.5 مل. جمد وخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. افحص اللوحات بحثا عن وجود ذكر C. ايليجانس. قم بإزالة جميع الذكور.
   <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: عادة ما يتم قياس العمر الخنثى وليس الذكور. تعيش الخنثى التي تتزاوج أقصر من غير المتزاوجة ، حتى في وجود FUdR. الذكور أصغر وأرق من الخنثى ويمكن التعرف عليها بسهولة من خلال ذيل معقوف مميز.
3. ضع الصندوق مرة أخرى في كيس القفل المضغوط. العودة إلى حاضنة 20 درجة مئوية.

2. جدوى التسجيل

1. سجل الجدوى يوميا عن طريق لمس رأس برفق بسلك بلاتيني أو رمش. قم بتسجيل التي تفشل في التحرك على أنها ميتة وإزالتها من اللوحة (الشكل 1 أ). سجل العدد الذي لوحظ ميتا لكل حالة لكل نقطة زمنية للمراقبة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لتقليل مخاطر تحيز التسجيل ، يجب أن يظل المجرب أعمى عن الظروف التجريبية وبالمثل يجب ألا يشير إلى النتائج من النقاط الزمنية السابقة أثناء التسجيل.
2. قم بمراقبة التي تتمزق أو تموت من عيوب نمو واضحة أخرى أو تزحف على جانب الطبق: قم بإزالة هذه وسجل الرقم في كل نقطة زمنية مرصودة للنظر فيها في التحليل الإحصائي. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم العثور على ذكور ، فقم بإزالتها وتسجيل الرقم الذي تمت ملاحظته.
3. كرر من الخطوة 2.1 يوميا حتى لا تبقى على قيد الحياة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا تضاءل عشب الإشريكية القولونية بشكل كبير أو بدأت الفطريات في النمو على اللوحة ، انقل جميع المتبقية إلى صفيحة جديدة مع RNAi و FUdR المناسبين.

النتائج

الشكل 1: طريقة المجموعة التقليدية والنسخة المتماثلة لتسجيل عمر C.elegans (أ). الطريقة التقليدية لتسجيل C. ايليجانس العمر. يتم اتباع العديد من المجموعات الصغيرة المتزامنة من متساوية المنشأ لكل حالة بمرور الوقت. يتم متابعة نفس مجموعة طوال دورة الدراسة. يتم تقييم الجدوى من خلال الحركة ، والتي يمكن تحفيزها عن طريق الحث اللطيف. يتم تسجيل التي تفشل في الحركة...

المواد

<حدود الجدول = "0" cellpadding = "0" cellpacing = "0" نمط = "العرض: 852 بكسل ؛" العرض = "854" > قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛ العرض: 343 بكسل ؛ "> FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) ألفا إيسار < td style="العرض:115px;">L16497 < نمط td = "العرض: 281 بكسل ؛ "> < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > 24 لوحات ثقافة الآبار غرينر بيو ون #662102 < ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >600 ميكرولتر 96 بئر غرينر بيو ون #786261 < ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >2 مل 96 بئر غرينر بيو ون #780286 <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > 96 دبوس لوحة النسخ المتماثل نونك هاتف: 250520 < td height = "19" style = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >C. elegans مكتبة استنساخ RNAi في بكتيريا HT115 - Ahringer المصدر: علم الأحياء مجموعة C. elegans RNAi (Ahringer) انظر أيضا Kamath et al, Nature 2003. C. elegans مكتبة استنساخ RNAi في بكتيريا HT115 - فيدال المصدر: علم الأحياء C. ايليجانس مورد ORF-RNAi (فيدال) انظر أيضا Rual et al, Genome Research 2004. هذه المكتبة متاحة أيضا من Dharmacon. L4440 بلازميد ناقلات فارغة أدجين 1654 < td style="العرض:281 بكسل;">https://www.addgene.org/1654/