الهضم الأنزيمي والتفكك اليدوي: طريقة لتحضير C. ايليجانس الأجنة لزراعة الخلايا

الملخص

المصدر: Sangaletti، R. and Bianchi، L. طريقة لزراعة الخلايا الجنينية C. ايليجانس.J. Vis. Exp.(2013).

يقدم هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا الجنينية C. ايليجانس وتعقيمها في المختبر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تفكك الخلايا الجنينية

1. قم بإجراء الخطوات التالية من الإجراء في ظل ظروف معقمة باستخدام غطاء التدفق الصفيحي. بينما ترتدي على ألواح البكتيريا ، فإن الغسالات والعلاج بمحلول التحلل الذي يحتوي على مادة التبييض يجب أن تقضي على معظم البكتيريا إن لم يكن كلها. وبالتالي ، فإن استخدام غطاء المحرك الصفحي في هذه المرحلة من الإجراء يمنع التلوث الجديد لتعليق البيض.
2. أعد تعليق البيض المحبب في 1 مل من 2 مجم / مل من الكيتيناز (المرق في الرقم الهيدروجيني للبيض 6.5) وانقله إلى أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 15 مل. هز الأنبوب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يتغير وقت الحضانة الدقيق وفقا لنضارة الإنزيم ودرجة حرارة الغرفة ، وبالتالي يجب تحديده لكل مستحضر. يوصى بالبدء في مراقبة البويضات تحت مجهر زراعة الخلايا المقلوب بعد 10 دقائق من الحضانة. ملاحظة: في تجربتنا ، يزيد انخفاض درجة الحموضة من النشاط الأنزيمي للكيتيناز. لهذا السبب نستخدم مخزن البيض عند درجة الحموضة 6.5 لإذابة الكيتيناز (الوصفة المذكورة أعلاه ، حيث يتم ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم).
3. عندما يتم هضم ~ 80٪ من قشر البيض عن طريق معالجة الكيتيناز (الأشكال 1 أ-ب) ، قم بحبيبات البيض عن طريق الطرد المركزي عند 900 × جم (~ 2,500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق. باستخدام ماصة P1000 وأطراف معقمة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأضف 3 مل من وسط L-15.
4. انقل البيض إلى طبق قطره 6 سم وقم بفصل الخلايا برفق باستخدام حقنة معقمة سعة 10 مل مزودة بإبرة 18 جراما. راقب درجة التفكك عن طريق وضع قطرة من المعلق في طبق بتري بلاستيكي طازج وعرضها تحت المجهر. لا تستنشق الهواء في المحقنة أثناء هذا الإجراء لتجنب إتلاف الخلايا. استمر في التفكك حتى يتم فصل ~ 80٪ من الخلايا.
5. قم بتصفية التعليق باستخدام فلتر Millipore معقم 5 ميكرومتر. يجب ترشيح معلقات الخلايا لإزالة كتل الخلايا والبيض غير المهضوم واليرقات المفرغة. قم بتصفية 4-5 مل إضافية من وسائط L-15 الجديدة من خلال الفلتر لاستعادة جميع الخلايا. لا تستخدم القوة المفرطة أثناء خطوة الترشيح لتجنب إتلاف الفلتر و / أو الخلايا.

< p class = "jove_title" >2. زراعة الخلايا

1. قم بتحبيير الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي عند 900 × جم (~ 2,500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق. باستخدام ماصة P1000 وأطراف معقمة ، قم بإزالة كل المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الخلايا المحببة في وسط L-15 كامل ولوحة 1 مل / بئر. تعتمد كمية الوسيط المضاف على رقم 8P اللوحات المستخدمة ، وملتقى الديدان على الصفائح ، ونوع التجارب التي سيتم إجراؤها على الخلايا. يمكن تحديد كثافة الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم. بالنسبة لتسجيلات التصحيح ، فإن كثافة الطلاء ~ 230،000 خلية / سم² هي الأمثل.
2. احتفظ بلوحة 24 بئرا في حاوية بلاستيكية تحتوي على مناشف ورقية مبللة لتجنب تبخر وسط الاستزراع. قم بتخزين الحاوية في حاضنة مرطبة عند 20 درجة مئوية والهواء المحيط.
3. عادة ما تكون الخلايا جاهزة للتجارب في غضون 24 ساعة عند اكتمال التمايز المورفولوجي والتعبير عن علامات GFP. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في المزرعة لمدة تصل إلى أسبوعين ولكنها عادة ما تكون أكثر صحة لمدة تصل إلى 7-9 أيام بعد الطلاء. يجب استبدال الوسط مرة واحدة يوميا للحفاظ على الخلايا السليمة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. C. ايليجانس الأجنة قبل وبعد العلاج بالكيتيناز. (أ) صورة فوتوغرافية للبيض قبل التعرض للكيتيناز. يشير السهم إلى قشر البيض الشفاف والسليم المحيط بالجنين. (ب) البويضات المعالجة بالكيتيناز لمدة 10 دقائق. تم هضم قشر البيض ولم يعد مرئيا حول الأجنة. تشير الأسهم إلى ثلاثة أضعاف الأجنة المنبعثة من قشر البيض. يحيط الصندوق الأزرق بمجموعة...

المواد

<حدود الجدول = "0" cellpadding = "0" cellpacing = "0" نمط = "العرض: 739 بكسل ؛" العرض = "738" > قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات <ارتفاع TD = "19" نمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ العرض: 437 بكسل ؛ ">الكواشف < td style="العرض:195px;"> < نمط td = "العرض: 107 بكسل ؛ "> < td height = "19" style = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > Leibovitz's L-15 سائل متوسط (1x) إنفيتروجين هاتف: 11415-064 مصل الأبقار الجنينية إنفيتروجين 16140-063 البنسلين - الستربتومايسين سيغما P4333-100 مل Chitinase من Streptomyces Griseus سيغما C6137-25UN الفول السوداني ليكتين سيغما L0881-10 ملغ <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > المعدات 101-1000 ميكرولتر أطراف ماصات زرقاء متدرجة الولايات المتحدة الأمريكية عطرية 1111-2821 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" >10 مل معقمة ملفوفة بشكل فردي الولايات المتحدة الأمريكية عطرية 1071-0810 <ارتفاع td = "19" نمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" >حجم متغير مريح (100-1000 ميكرولتر) ماصة مع قاذف طرف شركة VWR الدولية 89079-974 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ "> مساعد الماصات المحمولة ، دروموند شركة VWR الدولية 53498-103 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" >نقل البلاستيك معقم شركة VWR الدولية 14670-114 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ "> 15 مل أنبوب مخروطي الولايات المتحدة الأمريكية عطرية 1475-1611 < ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > إبر قياس 18 معقمة بيكتون وديكنسون وشركاه 305196 محاقن معقمة 10 مل بيكتون وديكنسون وشركاه 305482 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > مرشحات الحقنة البلاستيكية Corning 0,20 ميكرومتر حجم المسام كورنينج 431224 <ارتفاع td = "19" نمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" >مرشح حقنة Acrodic 25 مم مع غشاء versapor 5 ميكرومتر شركة VWR الدولية هاتف: 28144-095 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > 60 × 15 مم طبق بتري معقم شركة VWR الدولية 82050-548 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > 100 × 15 مم طبق بتري معقم شركة VWR الدولية 82050-912 <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > 12 مم قطر أغطية زجاجية شركة VWR الدولية 48300-560 < ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ "> لوحات ثقافة الخلية الشفافة 24 قاع مسطح بئر مع غطاء توماس العلمية 6902 أ 09 Dumont # 5- ملقط ناعم أدوات العلوم الدقيقة 11254-20 <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" >جهاز الطرد المركزي 5702 إيبندورف 22629883 غطاء التدفق الصفحي < td height = "19" style = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ ">المجهر المقلوب مع هدف x10 حاضنة ترطيب الهواء المحيط