ج. ايليجانس تتبع الحركة: طريقة لتقييم الحركة في الديدان

الملخص

المصدر: Davies ، A. G. et al. اختبار لقياس تأثيرات الإيثانول على سرعة حركة Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp.(2015).

يصف هذا الفيديو استخدام الفيديو وبرامج التتبع لتسجيل حركة الدودة في الساحة. يقيس بروتوكول المثال تأثير التعرض للإيثانول على حركة الدودة.

البروتوكول

البروتوكول التالي هو مقتطف من Davies et al ، اختبار لقياس تأثيرات الإيثانول على سرعة حركة Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2015).

1. خطوات لتنفيذها في اليوم السابق للفحص

   1. اختر ديدان المرحلة L4 إلى أطباق وسط نمو الديدان الخيطية الطازجة (NGM) المصنفة بحديقة من OP50 E. coli ، وزرعها عند 20 درجة مئوية O / N. تتطلب كل حالة فحص 10 ديدان. اختر فائضا من الديدان للسماح بفقدان O / N للديدان.
      1. فقط فحص التي هي بالغة في اليوم الأول ؛ تنمو العديد من المسوخ بسرعة أبطأ من النوع البري. اضبط توقيت اختيار السلالات التي تعاني من تأخر في النمو بحيث تكون جميع التي تم اختبارها بالغة في اليوم الأول.
2. خطوات الإجراء في يوم الفحص
   1. التحضير للمقايس:
      1. قم بإجراء فحوصات على ألواح NGM القياسية غير المصنفة مقاس 60 × 15 مم. جفف جميع الأطباق المراد استخدامها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، مع إغلاق الأغطية. لكل تجربة تجريبية ، استخدم أربع لوحات NGM المجففة. ستكون هذه هي لوحات فحص الإيثانول 0 ملي مولار و 400 ملي ولوحات التأقلم المصاحبة لها.
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: استخدام لوحات NGM مهم هنا. يمكن أن تؤثر الاختلافات في تكوين الألواح ، ولا سيما الأسمولية ، بشدة على استجابة جرعة الإيثانول على السلوك ، ويرجع ذلك ، جزئيا على الأقل ، إلى التغيرات في كمية الإيثانول المتراكمة لدى. أجار NGM هو 160 mOsm.
      2. بعد التجفيف ، قم بوزن كل لوحة من ألواح NGM غير المصنفة لاستخدامها في الفحص ولاحظ الوزن. حدد حجم الوسائط في اللوحات بناء على وزن اللوحة الفارغة. لتقريب تحويل وزن الأجار إلى الحجم ، افترض أن الوسائط تزن نفس الحجم المتساوي من الماء.
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تم العثور على نتائجنا الأكثر اتساقا مع وسائط NGM التي جفت بدرجة كافية بحيث يكون حجم 10 مل الأصلي له حجم ما بعد التجفيف يتراوح بين 8.3-8.9 مل. بديل لوقت الجفاف لمدة ساعتين هو التجفيف حتى تصل الألواح إلى نطاق الحجم هذا لمراعاة الاختلافات في الحاضنات.
      3. قم بإذابة 4 حلقات نحاسية (قطر داخلي 1.6 سم) في سطح كل لوحة لتكون بمثابة حظائر للأنماط الجينية المختلفة أو مجموعات معالجة الديدان. أمسك كل حلقة بالملقط ، وقم بتسخينها في اللهب (لهب قوي من موقد بنسن يعمل بشكل جيد) لمدة 3 ثوان تقريبا. ضع الحلقة على الفور على طبق مع الاستمرار في إمساك الحلقة بالملقط لمنعها من "القفز".
         1. تأكد من أن الحلقة تستقر بشكل مسطح على سطح الأجار عن طريق الضغط برفق باستخدام الملقط في عدة نقاط على الحلقة. عند وضع الحلقة ، احرص على ترك مساحة لثلاث حلقات إضافية.
         2. قم بإذابة الحلقات النحاسية الثلاث الإضافية في سطح اللوحة ، مع الحرص على وضعها بالقرب من بعضها البعض قدر الإمكان بحيث تكون الحلقات الأربعة في مجال رؤية الكاميرا.
            <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يعد عمل ختم جيد باستخدام الأجار أمرا ضروريا لإبقاء الديدان في الحلقات أثناء الفحص. من غير المرجح أن تصنع الحلقات التي تتخطى على اللوحة الختم الصحيح مع الأجار وقد تندب الأجار ، مما يسمح للديدان بالحفر ويتداخل مع تصور الديدان.
         3. لكل لوحة فحص ، قم بإعداد لوحة "التأقلم" المصاحبة ، والتي يجب تجفيفها وغير مصنفة ولن تتلقى أي إيثانول. ضع أربع حلقات نحاسية على هذه الألواح.
      4. قم بتسمية الجزء السفلي من الألواح بجوار كل حلقة بسلالة الدودة لاستخدامها في الحلقة ، مع الحرص على عدم الكتابة في مجال رؤية الحلقة نفسها. قم بمطابقة الملصقات الموجودة على لوحة الفحص مع لوحة التأقلم المصاحبة لها.
      5. احسب كمية الإيثانول بنسبة 100٪ لإضافتها إلى كل لوحة فحص بحيث يكون التركيز النهائي 0 ملي مولار أو 400 ملي مولار من الإيثانول (الوزن إلى الحجم). لكل تجربة (ن = 1) ، سيكون هناك لوحة إيثانول واحدة 0 ملي وواحدة 400 ملي مولار. لوحات التأقلم لا تتلقى الإيثانول. أضف الإيثانول ، وقم بسحب ماصته حول سطح اللوحة. استخدم فيلم المختبر لإغلاق اللوحة والسماح لها بالتوازن على سطح المقعد لمدة ساعتين.
      6. عند انقضاء 1.5 ساعة ، ابدأ خطوة التأقلم في الفحص ، الخطوة 2.2.
   2. إجراء فحص الحركة: لوحات الفحص
      1. انقل بعناية 10 ديدان من كل مجموعة تجريبية إلى مركز حلقة نحاسية على لوحة التأقلم. قم بإزالة أي طعام مرئي على الأجار في هذه المرحلة عن طريق الكشط برفق باستخدام معول الدودة. قم بتغيير الترتيب الذي يتم به وضع المجموعات التجريبية على اللوحات عبر التجارب التجريبية بحيث لا يتم وضع نفس السلالات على الألواح بنفس الترتيب عبر التجارب.
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: الهدف هو نقل إلى الطبق بكميات قليلة من الطعام ، لأنه إذا تم نقل الطعام الموجود على لوحة التأقلم إلى لوحة الفحص ، فسوف تتجمع الديدان حول الطعام وسيتم حجب تأثير الدواء على الحركة.
      2. احرص على عدم كسر سطح الأجار باستخدام المعول ، لأن ذلك سيسمح للديدان بالحفر وسيعطل الفحص. احتضن الديدان في RT لمدة 30 دقيقة.
      3. تأكد من وجود فاصل زمني مناسب بين بدء كل لوحة. يمكن للمجرب المتمرس تحريك 40 ، 10 / حلقة ل 4 حلقات في < 1.5 دقيقة ، ولكن أي فاصل زمني يصل إلى دقيقتين مقبول. يحتوي الاختبار القياسي على أفلام تسجل عند 10-12 دقيقة و 30-32 دقيقة من التعرض لكل من 0 ملي مولار و 400 ملي مولار من الإيثانول.
      4. ابدأ لوحة التأقلم للتعريض الضوئي 0 ملي مولار ولوحة التأقلم للتعريض الضوئي 400 مللي مولار على بعد دقيقتين و30 ثانية تقريبا للسماح بحفظ ملف الفيلم الأول قبل بدء الفيلم الثاني.
      5. بعد فترة التأقلم التي تبلغ 30 دقيقة ، انقل الديدان من ألواح التأقلم إلى لوحات الفحص. انقل الديدان إلى ألواح الفحص (0 ملي مولار أو 400 ملي مولار من الإيثانول) بنفس الترتيب الذي تمت إضافتها به إلى لوحة التأقلم ، مع تتبع التوقيت بين عمليات إكمال كل لوحة. أغلق اللوحة بغشاء مختبري لتقليل فقد الإيثانول للتبخر.
      6. استخدم حركة الغرف باستخدام عود دودة مسطحة رفيعة الحواف لجمع الديدان فوق المعول المسطح. قم بإجراء نقل الديدان من لوحة التأقلم غير المصنفة إلى لوحة الفحص دون استخدام البكتيريا ، والتي تستخدم بشكل شائع في نقل الديدان لأنها تساعد على لصق الدودة بالانتقاء.
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تعد السرعة التي يتم بها نقل في هذه الخطوة مهمة للغاية لأن الديدان الأولى على اللوحة ستتعرض للإيثانول لفترة أطول من الديدان الأخيرة المضافة إلى اللوحة ، وقد تظهر النقاط الزمنية السابقة بعض التأثيرات المعتمدة على الوقت. هذا هو السبب الرئيسي لتدوير السلالات التي يتم وضعها على صفيحة أولا عبر التكرارات التجريبية.
   3. إجراء فحص الحركة: التصوير
      1. استخدم مجموعة مجهر/كاميرا تسمح بالتصوير المتزامن لجميع الحلقات الأربع في مجال الرؤية (حوالي 42 × 42 مم² مربع)، مثل هدف المجهر 0.5x والتكبير 0.8x وكاميرا CCD بدقة 2048 × 2048 7.4 ميكرومتر بكسل.
      2. استخدم الإضاءة المتساوية عبر مجال الرؤية ، مما يساعد في التعرف على الكائن عند خطوة عتبة الشدة. تعمل الإضاءة الخلفية مقاس 3 × 3 بوصات بشكل جيد.
      3. قم بتصوير الديدان على لوحة موضوعة على جانب الوسائط لأعلى (الغطاء لأسفل) ، مما يولد تباينا مفقودا عند استخدام الإضاءة الخلفية مقارنة بمصدر الضوء المنقول بالمجهر التقليدي.
      4. قم بإعداد برنامج تحليل الصور لالتقاط أفلام بفاصل زمني للديدان المتحركة. اضبط البرنامج لالتقاط صور بحجم 12 بت بمقياس رمادي كل 1 ثانية، كفيلم مدته دقيقتان (120 إطارا). لتقليل حجم ملف الإخراج، مع الاستمرار في الاحتفاظ بدقة صورة كافية، استخدم وضع تجميع 2x2 لالتقاط صور بدقة 1024 × 1024 بكسل.
      5. سجل الأفلام. ابدأ في تسجيل فيلم مكون من 120 إطارا للوحة الأولى (0 ملي مولار من الإيثانول) بعد 10 دقائق من وضع الديدان الأخيرة على تلك اللوحة. احفظ ملف الفيلم.
      6. سجل اللوحة الثانية (400 ملي مولار من الإيثانول). كرر هذه العملية لكلتا اللوحين بدءا من 30 دقيقة بعد وضع الديدان الأخيرة على اللوحة الأولى (0 ملي مولار من الإيثانول) لالتقاط 30-32 دقيقة من النقاط الزمنية لكل تعرض.
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: اترك وقتا كافيا لحفظ ملفات الصور بعد كل جلسة التقاط قبل البدء في تسجيل اللوحة التالية المراد تحليلها.
      7. للتدقيق المستقبلي للأفلام المؤرشفة وللسماح بفتح هذه الأفلام وتحليلها بواسطة برامج تصوير مفتوحة المصدر أخرى للملكية العامة ، مثل ImageJ ، قم بتحويل نسخة من كل فيلم إلى ملفات TIFF ذات مقياس رمادي 8 بت><. <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يستخدم برنامج تحليل الصور الموضح هنا تنسيق ملف خاص.

المواد