تحضير عينة لعمليات التمثيل الغذائي: طريقة لتحضير عينات الخلايا للتنميط المستقلب

الملخص

المصدر: Zhao، Y. C. et al.، أنظمة بيولوجيا التنظيم الأيضي عن طريق إشارات مستقبلات هرمون الاستروجين في سرطان الثدي. J. Vis. إكسب. (2016).

يصف هذا الفيديو تقنية لإعداد عينات خلايا سرطان الثدي لتنميط المستقلب. يتم علاج خلايا سرطان الثدي بالاستراديول ، الذي يرتبط بمستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ويسبب تغييرا في تكوين المستقلب.

البروتوكول

1. إعداد عينة فحص التمثيل الغذائي

1. زراعة الخلايا وعلاجها
   1. بذور 400,000 MCF7 خلية لكل صفيحة 10 سم في وسط النمو. لكل علاج ، قم بإعداد ثلاث عينات. استخدم لوحين في كل عينة لتلقي خلايا كافية للاكتشاف. في اليوم 3 ، قم بإزالة الوسط وأضف 5 مل من الوسط الطازج مع أو بدون ^10-8 M Estradiol أو E2 إلى الخلايا. عالج الخلايا لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة₅٪ ثاني أكسيد الكربون
   ).
2. جمع العينات
   1. أضف 5 مل من الثلج البارد 1x PBS إلى الطبق ، واستنشق PBS بعد إمالة اللوحة لفترة وجيزة عدة مرات. كرر مرتين ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS بعد الغسيل الأخير.
   2. أضف 750 ميكرولتر من الأسيتون قبل البرودة إلى كل لوحة واكشط الخلايا. اجمع الخلايا في الأسيتون من طبقين في أنبوب سعة 2 مل على الجليد.
   3. عدد الخلايا للتطبيع
      1. لكل علاج ، استخدم لوحين إضافيين لقياس كمية الخلية. لفك توصيل الخلايا من اللوحة ، أضف 2 مل من المخزن المؤقت HE (1x HBSS ، و 10 ملي هيبس ، و 0.075٪ NaHCO_{3 ،} و 1 ملي مولار EDTA) في كل لوحة واحتضانها لمدة 5 دقائق.
      2. اجمع الخلايا واخلطها جيدا عن طريق سحب الخلايا في المخزن المؤقت لكفاءة الطاقة. استخدم إجمالي 20 ميكرولتر من محلول الخلية لحساب عدد الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم.
3. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية قبل إرسالها إلى مركز التمثيل الغذائي لتحديد وتحديد المستقلبات باستخدام تحليل قياس الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز (GC-MS).