نظهر بروتوكول للعزلة جبلة المحوار من العصب الوركي الجرذان الكبار على أساس تشريح الأعصاب وكراسات الحضانة في المتوسط للإفراج ناقص التوتر وليز الميلين غير محواري الهياكل ، تليها استخراج المواد محوار التخصيب المتبقية.
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بمعزل عن السيتوبلازم محواري النقي (جبلة المحوار) من الأعصاب الطرفية أمر حاسم للدراسات الحيوية في العديد من العمليات البيولوجية. في هذه المقالة ، علينا أن نظهر ووصف بروتوكول للعزلة جبلة المحوار من العصب الوركي الجرذان الكبار على أساس الخطوات التالية : (1) تشريح الأعصاب والكراسات فصل النسيج الضام ، (2) حضانة شرائح قصيرة من الكراسات في العصب المتوسط ناقص التوتر الافراج الميلين وليز غير محواري الهياكل ، و (3) استخراج المواد محوار التخصيب المتبقية. أكدت توصيف البروتين والبيوكيميائية هذا المستحضر على درجة عالية من التخصيب لمكونات المحاور.
البروتوكول
هذا البروتوكول يسمح العزلة جبلة المحوار مع التقليل من تلوث الأنسجة والأوعية الدموية الدبقية. الأسلوب غلة حوالي 70-100 ميكروغرام جبلة المحوار البروتين الكلي الواحد الفئران الأسبوع 80-10 يستار القديمة.
1. تشريح الأعصاب الوركي
- الموت ببطء two الفئران عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون 2 تليها خلع عنق الرحم. تأكيد الموت لعدم وجود تحسس نبض القلب قبل بداية تشريح.
- المسحة مجال التشريح مع الايثانول 70 ٪.
- قطع الجلد والعضلات منفصلة وعزل العصب الوركي باستخدام مقص وملقط بعناية دون الأوعية الدموية المدمرة. تشريح الأعصاب كلا الوركي (حوالي 1.5 سم لكل منهما) من كل حيوان ، وجمع كل الأعصاب الأربع في إيبندورف مع 500 ميكرولتر مثبطات PBS + 0.2X ، حافظ على الجليد.
- نقل القطع إلى العصب الصحون البلاستيكية التي تحتوي على ما لا يقل عن 2 مل من 0.2X مثبطات الأنزيم البروتيني PBS +.
- إزالة غلاف من الأعصاب باستخدام الملقط غرامة بموجب نطاق مجهر. فصل كراسات بعناية فائقة حتى يصبح غائما وبداية لتطفو على السطح من الحل. يجب أن تمارس هذه الخطوة حتى يمكن إجراء ذلك بسرعة وبدقة (وليس مع أكثر من 10 دقيقة في العصب).
2. الحضانة ، وشطف الغسيل
- نقل فصل كراسات لأنبوب إيبندورف الطازجة مع 500 ميكرولتر من 0.2X PBS تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني للحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل ما لا يقل عن 3 مرات مع 1 مل من المخزن نفسه عن طريق نقل كراسات إيبندورف من أنبوب إلى أنبوب إيبندورف وتهتز لمدة 5 دقائق بعد نقلها.
- لإزالة الفائض من السوائل وضعت في أنبوب كراسات إيبندورف فارغة جديدة ومن ثم نقل إلى كراسات أنبوب إيبندورف جديدة مع 300 ميكرولتر من 1X PBS التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني للحضانة لمدة 20-30 دقيقة في RT.
- أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 10000 XG في 4 درجات مئوية.
- اتخاذ طاف وقياس تركيز البروتين. هذا هو الإعداد الخاص جبلة المحوار.
3. ممثل النتائج
الشكل 1. جبلة المحوار الغربية لطخة مقارنة المعزولة بسبب أسلوب الضغط اليدوي مع عينات جبلة المحوار معزولة كما هو مبين في هذا البروتوكول. لاحظ انخفاض مستويات الزلال وGFAP ، وهو ما يمثل بروتين الدم والخلايا الدبقية التلوث ، على التوالي. في المقابل ، هو المخصب محواري B3 تويولين في هذا التحضير ، مما يدل على مستوى عال من البروتينات محواري.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أكدت التحاليل البيوكيميائية والبروتين أن هذا الإجراء يقلل من تلوث الدم والخلايا الدبقية 3 بالمقارنة مع الأساليب المذكورة سابقا لعزل جبلة المحوار بواسطة الضغط الميكانيكي 1. وقد استخدمنا هذا البروتوكول العزلة جبلة المحوار لاستكشاف داينين المستندة إلى إشارات إلى الوراء بعد إصابة العصب الوركي 2 ، وتتوقع أن تكون ذات منفعة في استكشاف عمليات أخرى كثيرة في الأعصاب الطرفية الكبار ، بما في ذلك محور عصبي - الدبقية التفاعلات 4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
المواد
- الفئران الذكور ويستار (8-10 أسابيع من العمر)
- PBS PBS 0.2X والحلول التي تحتوي على الأنزيم البروتيني 1X مثبطات (Roshe) 2 حبة لكل 50 مل
- Eppendorfs مقابل 1.5 مل
- تعقيم الصحون البلاستيكية 35 مم
- تشريح الأدوات بما في ذلك : مقص وملقط غرامة
- مجهر والجدول ضوء
الأضداد
وكان الماوس المضادة للاستنساخ GFAP GA - 5 من سيغما (G6171). كان الأرنب مكافحة الزلال من Cedarlane (CLAG5140). والماوس المضادة للتويولين β3 والأرانب مكافحة gERK من سيغما (T2200 وM5670 على التوالي).
المراجع
- Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron. 40, 1095-1104 (2003).
- Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).
- Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve. Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).
- Twiss, J. L., Fainzilber, M. Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors. Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن