Method Article

تصور المتماثل الحمض النووي في خلايا فردية عن طريق تضخيم الإشارات EDU

DOI:

10.3791/2147

⸱

November 15th, 2010

 ,  , 
1Michigan Research Community, Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورنا تقنية حساسة لتسمية الحمض النووي توليف حديثا (و mtDNA) في الخلايا الفردية ، من أجل دراسة و mtDNA نشوء حيوي. أسلوب يجمع بين إدماج ايدو مع بروتوكول إشارة tyramide (TSA) التضخيم لتصور و mtDNA تكرارها داخل المقصورات التحت خلوية من الخلايا العصبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي المنظمين الرئيسيين للطاقة الخلوية ونشوء حيوي الميتوكوندريا هي عنصر أساسي من عناصر تنظيم أعداد الميتوكوندريا في الخلايا السليمة 1-3. نهج واحد لرصد نشوء حيوي الميتوكوندريا هو قياس معدل الحمض النووي (و mtDNA) تكرار 4. طورنا تقنية حساسة للتسمية و mtDNA تصنيعه حديثا في الخلايا الفردية ، من أجل دراسة و mtDNA نشوء حيوي. أسلوب يجمع بين إدماج - 5 - إيثينيل 2' - deoxyuridine (ايدو) 5-7 مع تضخيم إشارة tyramide (TSA) 8 و mtDNA بروتوكول لتصور تكرارها داخل المقصورات التحت خلوية من الخلايا العصبية. EDU متفوقة على النظير ثيميدين أخرى ، مثل 5 برومو deoxyuridine - 2 (BrdU) ، لأن رد الفعل الأولي لايدو فوق التسمية 5-7 لا تتطلب علاجات حمض القاسية أو هضم أنزيم التي مطلوبة من أجل فضح حاتمة BrdU . وأكثر اعتدالا توسيم ايدو يسمح للمقارنة مباشرة لتأسيسها مع علامات الخلوية الأخرى 9-10. القدرة على تصور وتحديد نشوء حيوي و mtDNA يوفر أداة أساسية عن التحقيق في الآليات المستخدمة لتنظيم نشوء حيوي الميتوكوندريا وستوفر نظرة ثاقبة على المرضية المرتبطة سمية الدواء ، والشيخوخة والسرطان وأمراض الاعصاب. أسلوبنا ينطبق على الخلايا العصبية الحسية ، وكذلك أنواع الخلايا الأخرى. استخدام هذه التقنية لقياس و mtDNA نشوء حيوي لها انعكاسات كبيرة في تعزيز فهم الفيزيولوجيا الخلوية العادية وكذلك الحالات المرضية غير جيدة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلايا العصبية

  1. تزرع عقدة الجذر الظهري (DRG) الخلايا العصبية على العقيمة (تعقيمها) 12 ملم coverslips الزجاج في صفيحة الثقافة 24 أيضا.
  2. هو المخفف للسهم من 10 مم ايدو (في DMSO ، انقر EDU - IT كيت الفحص Microplate) 1:100 عادة في مستنبت لجعل حل ايدو 10X (100 ميكرون) والمخففة ثم 1:10 في آبار الثقافة (على سبيل المثال 30 ميكرولتر من الحل ايدو 10X في ما مجموعه 300 ميليلتر من مستنبت). يتم تحضين الخلايا العصبية DRG مع تركيز النهائي من ايدو 10 ميكرومتر في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 بين 2-24 ساعة. طول الوقت يعتمد على كيفية العلاج تؤثر على معدل تخليق و mtDNA.
  3. في غطاء الدخان ، يتم إصلاح الخلايا العصبية في DRG بارافورمالدهيد 2 ٪ لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وغسلها مرتين في 1X PBS 2-5 دقائق يغسل كل وتخزينها في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة لمدة تصل إلى 1 في شهر 4 درجات مئوية.
  4. يتم نقل Coverslips مع غرامة يميل ملقط إلى الحجرة الرطبة أعدت (كورنينج طبق الأحيائي مع القاع منجد السوداء لالنقيض من ذلك ، ملفوفة في رقائق الألومنيوم لحماية المكونات الحساسة للضوء ومرطب مع Kimwipes المشبعة بالماء) ويوضع على ورقة من M Parafilm الذي يوفر سطح مسعور لحصر حلول للساترة. ويهدف البروتوكول لمدة 28 أدناه coverslips ونحن على استعداد للحلول 32 coverslips (حوالي 14 ٪ حجم اضافية). مصنوعة حلول مع عناصر مكلفة أو محدودة بحيث يتم استخدام 75-80 ميكرولتر على كل ساترة. خلاف ذلك ، تستخدم 200-300 ميكرولتر عن حلول لمنع غسل ويغسل جيدا من الحلول السابقة.
  5. إعادة تطبيق 1X PBS لتغطية سطح كل ساترة (200-300 ميكرولتر). إعداد مقايسة النقر عليه وتضخيم إشارة tyramide مجموعات على النحو المبين أدناه وتعليمات الشركة الصانعة.

إعداد IT - انقر ايدو Microplate الفحص كيت

معظم المكونات من مجموعة ايدو انقر - IT الفحص Microplate تأتي مسبقة الصنع ويتم تخزينها في 4 درجات مئوية [2X اضغط - IT الاحتياطي رد الفعل (E 10X مكون) ، CuSO4 (100 مم ، مكون F) ، انقر فوق - IT ايدو تثبيتي ( العنصر D) وحظر مؤقت (2X مكون H)]. يتم تخزين فوق - IT المضافة الاحتياطي ايدو (G مكون 10X) في -20 درجة مئوية لمنعها من التحول الأصفر والبني مع مرور الوقت. هذا المكون تتسامح المتكررة تجميد أذاب دورات.

ينبغي تقسيم الخضراء ولاية أوريغون 488 آزيد (B مكون) في aliquots الصغيرة (10-20 ميكرولتر) للحد من ذوبان تجميد دورات وتخزينها على -20 درجة مئوية.

لإعداد محلول المخزون من المتقارن مكافحة أوريغون HRP الأخضر (المكون الأول) ، إضافة س 75 ميكرولتر من الملة O 2 درهم للقنينة. مزيج لطيف من قبل pipetting أو انعكاس لتجنب رغوة وتخزينها في 4 درجات مئوية. لا الدوامة.

إعداد مجموعة TSA # 12 ، مع مفتش HRP المضادة للأرنب عنزة واليكسا فلور 488 كيت Tyramide

لتحضير محلول المخزون tyramide ، تذوب المواد الصلبة (488 tyramide اليكسا فلور ، مكونات A) في 150 ميليلتر من DMSO (مكون B). اقلب القنينة عدة مرات لإذابة أي طلاء tyramide الجانبين من القارورة. حل تخزين الأوراق المالية في aliquots الصغيرة (10-20 ميكرولتر) في ≤ -20 درجة مئوية ، والمجفف ومحمية من الضوء.

2. فوق - IT - 5 - 2 - إيثينيل deoxyuridine (ايدو) وصفها

ملاحظة : يتم إزالة جميع الحلول مع لمبة ماصة نقل معلومات سرية مع 200 ميكرولتر الملصقة على نهاية بلطف لإزالة السوائل من دون فقدان الخلايا. تجنب استخدام خط فراغ ، والتي عادة إزالة الحلول بقوة أيضا. ويستخدم ماصة لمبة الفيضانات coverslips بلطف مع 200-300 ميكرولتر من الحلول لغسل اغسل من الحل السابق.

  1. وpermeabilized الخلايا بنسبة 0.1 ٪ تريتون - X - 100 في حل PBS 1X لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الحجرة الرطبة المغطاة. استخدام 1 ٪ تريتون - X - 100 حلول المخزون.
    • جعل ميكرولتر من 3000 بنسبة 0.1 ٪ تريتون - X - 100 وذلك بإضافة 300 ميكرولتر 1 ٪ تريتون - X - 100 سهم ل2700μL 1X PBS.
    • 75-80 استخدام ميكرولتر في ساترة.
  2. إزالة X - 100 تريتون الحل وشطف مرتين مع 1X PBS.
  3. هو مروي الذاتية النشاط البيروكسيداز من 1 ٪ H 2 O 2 في حل PBS 1X لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. المخفف 30 ٪ H 2 O 2 حل مع 1X PBS. وينبغي بذل هذا الحل الطازجة ولكن يمكن قطعها خلال الخطوة permeabilization الدقيقة 10 أعلاه (الخطوة 3.1).
    • جعل ميكرولتر من 3000 بنسبة 1 ٪ H 2 O 2 بإضافة 100 ميكرولتر 30 ٪ H 2 O 2-2900 1X PBS ميكرولتر.
    • 75-80 استخدام ميكرولتر في ساترة.
    • إزالة الحل البيروكسيداز وشطف مرتين مع 1X PBS.
  4. فوق - IT ايدو الرد
    • لمدة 32 coverslips (32 × 80 = ميكرولتر2560 ميكرولتر) هناك حاجة الى ما مجموعه 2560 ميكرولتر. يرصد رد فعل في 1280 2X ميكرولتر ، وهو نصف إجمالي حجم رد الفعل.
    • تحضير الكوكتيل الطازج الرد النقر عليها قبل البدء في إصلاح آخر 5 دقائق (الخطوة 3.5 أدناه).
    • مزج كوكتيل بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. لا الدوامة عند اتخاذ رد الفعل هذا.
      س 2 كوكتيل الرد
      المكونات هي من IT - انقر ايدو Microplate الفحص كيت             		نصف الحجم : 1280 ميكرولتر
      ملي س درهم 2 O 1132.8 ميكرولتر
      2X الاحتياطي الرد النقر عليه (E 10X مكون) 100.3 ميكرولتر
      فوق - IT المضافة الاحتياطي ايدو (G مكون 10X) 25.6 ميكرولتر
      كبريتات النحاس 4 (100 مم ، مكون F) 25.6 ميكرولتر
      أوريغون الخضراء آزيد (مكون) 6.4 ميكرولتر
      مجموع 1290.7 ميكرولتر

      ملاحظة : وحدات التخزين المستخدمة أعلاه متناسبة مع حجم المسرودة في انقر EDU - IT الاتجاهات Microplate طقم الفحص. حجم رد الفعل النهائي من كوكتيل هو أكثر بقليل من 1280 ميكرولتر.
    • انقر - IT 2X يتم تخفيف رد فعل على قدم المساواة مع حجم IT - انقر ايدو تثبيتي (مكون D) الحق قبل الاستخدام. خلط هذه معا يجعل حل رد فعل موحد لجميع coverslips.
    • إضافة 1290.7 - IT ميكرولتر انقر ايدو تثبيتي (مكون D) إلى رد فعل ميكرولتر كوكتيل 1290.7. 75-80 استخدام ميكرولتر في ساترة.
  5. بعد إصلاح الخلايا العصبية معها ، انقر فوق ايدو تثبيتي (D مكون) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. إزالة الإصلاح وإضافة الكوكتيل رد فعل من قبل (الخطوة 3.4). غطاء للحماية من الضوء واحتضان لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بلطف كوكتيل التفاعل. تغسل مرتين مع الاحتياطي 1X المخفف الحظر (2X H مكون).
    • جعل ميكرولتر من 5200 1X الاحتياطي بتخفيف الحظر 2600 ميكرولتر حظر مؤقت (2X مكون H) مع حجم مساو من د MilliQ O 2 H (2600 ميكرولتر). 75-80 استخدام ميكرولتر في ساترة.
  7. تحت المجهر EPI - الفلورسنت ، والاختيار لتلطيخ الخضراء ولاية أوريغون في نوى الخلايا mitotically التحكم النشط.

3. Tyramide تضخيم الإشارات (TSA) من الإشارات EDU

  1. إضافة 1 ٪ حل لكل كتلة TSA ساترة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    • جعل ميكرولتر 6000 من 1 ٪ حل كتلة وزنها 0.06 TSA بواسطة غرام من الكاشف TSA الحظر (TSA طقم # 12 ، مكونات D) وإضافتها إلى 6000 1X PBS ميكرولتر. الدوامة إلى المزيج. وإضافة مصل الماعز 5 ٪ في حل 1 ٪ كتلة TSA غالبا ما يساعد على خفض غير محددة وملزمة.
  2. تدور لفترة وجيزة لمكافحة أوريغون البيروكسيداز الفجل الأخضر مترافق الأسهم الضد (العنصر الأول من الفحص اضغط Microplate EDU - IT) ، الذي أعد 2-24 ساعات في وقت مبكر من TSA. تمييع الضد 1:300 الابتدائية في 1 ٪ TSA حل الحجب والمقلوب أو ماصة بلطف صعودا ونزولا إلى المزيج. لا لتجنب دوامة تعطيل الضد HRP - مترافق. إزالة 1 ٪ حل كتلة TSA ، إضافة إلى 75 ميكرولتر كل ساترة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    • ويمكن استخدام الأجسام المضادة أكثر تركيزا ، مثل 1:150 ، ولكن توفيره بكميات محدودة ، واستخدام ذلك لماما. مرة أخرى ، سيكون إضافة مصل الماعز 5 ٪ في محلول 1 ٪ كتلة TSA غالبا ما يساعد على خفض غير محددة وملزمة للجسم الأخضر المضادة للأوريغون البيروكسيداز الفجل مترافق.
    • 2560 ميكرولتر جعل من حل الضد 1:300 بإضافة 8.53 ميكرولتر من أرنب الأسهم مكافحة أوريغون الأخضر HRP (انقر - Iتي إيدو Microplate الفحص) إلى 2560 ميكرولتر الحظر TSA 1 ٪. مزيج لطيف من قبل pipetting أو انقلاب.
  3. في اليوم التالي ، وإزالة الأجسام المضادة وشطف حل ثلاث مرات مع 1X PBS. لاحتضان coverslips في غسل النهائي لدقائق 30-60 إضافية في درجة حرارة الغرفة لضمان أن تتم إزالة الأجسام المضادة غير منضم الابتدائي.
  4. إعداد رد فعل لTyramide 2560 ميكرولتر (32 × 80 coverslips ميكرولتر).
    • جعل 400 ميكرولتر من 0.15 ٪ H 2 الحل 2 O (100X) وذلك بإضافة 2 ميكرولتر من 30 ٪ H 2 O 2 (TSA طقم # 12 ، مكونات F) إلى 398 مخزن التضخيم ميكرولتر (TSA طقم # 12 ، E مكون) . وينبغي بذل هذا الحق المطلوبة من قبل.
    • عن الحجم النهائي من 2560 ميكرولتر الجمع :
      • Tyramide 25.6 - 488 ميكرولتر (TSA طقم مكون A)
      • 2508.8 الاحتياطي التضخيم ميكرولتر (TSA E مكونات الطقم)
      • 25.6 ميكرولتر 0.15 ٪ H 2 O 2 (من فوق ل٪ 0.0015 النهائي H 2 O 2)
      • إزالة 1X PBS واحتضان تفاعل مع Tyramide لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. رد فعل وإزالة Tyramide شطف ثلاث مرات مع 1X PBS ، تفرخ في غسل النهائي ل30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة كما كان من قبل.
  6. الاختيار لوضع العلامات و mtDNA تحت المجهر EPI - الفلورسنت.
    • coverslips جبل على شرائح ميكروسكوب مع تصاعد antifade المتوسطة ، مثل إطالة الذهبية مع دابي. بدلا من ذلك ، يمكن تتبع العلامات ايدو والتضخيم من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية الفلورسنت القياسية لتسمية علامات الخلوية الأخرى.

4. نتائج ممثل : التصور من النسخ المتماثل الحمض النووي كعلامة للالنشوء الأحيائي الميتوكوندريا

ونحن مهتمون في كيفية الخلايا العصبية الحسية (الشكل 1) تنظيم عدد من الميتوكوندريا. وهذا البروتوكول و mtDNA التسمية المركبة حديثا مع علامة فلوري كوسيلة لقياس الميتوكوندريا جديدة. إدماج ايدو في النوكليوتيدات الاصطناعية تليها الكيمياء فوق ولاية أوريغون من التضخيم الأخضر آزيد واللاحقة مع نتائج 488 - اليكسا فلور tyramide في وسم و mtDNA مع الإشارات الفلورية الخضراء (الشكل 2). إذا فعلت بشكل صحيح ، وتضخيم إشارة خضراء هو أعلى بما فيه الكفاية من مضان الخلفية (مثل تألق ذاتي الخلوية أو من الآثار الجانبية للتفاعل HRP - TSA).

تم تصميم هذه التقنية لتسمية و mtDNA منسوخة حديثا من أجل رؤية وتحديد نشوء حيوي داخل المقصورات و mtDNA التحت خلوية من الخلايا العصبية (الشكل 3). وسم ايدو يسمح للكيمياء سيتولوجية مناعية الفلورسنت لاحقة لتسمية علامات الخلوية الأخرى مثل neurofilament (الشكل 3D).

ويمكن أيضا أن يكون رد الفعل TSA فعلت مع غيره من الفلورسنت tyramides فلور اليكسا مثل فلور اليكسا 594 - tyramide. هذه النتائج في إشارة خضراء النووية الفلورسنت من فوق ولاية أوريغون رد فعل خضراء آزيد في النواة ولكن عدم وجود إشارة خضراء في و mtDNA التي لا يمكن الكشف عنها قبل الاتفاق. والتضخيم مع فلور اليكسا 594 - tyramide يكثف التسمية النووية ويكشف عن ايدو و mtDNA مع إدراجها في الإشارات الحمراء الفلورسنت (الشكل 4). يستخدم الإجراء التضخيم مشابهة لتصور BrdU إدماجها و mtDNA تصنيعه حديثا (الشكل 5) ، ولكن هذا الأسلوب يتطلب خطوة إضافية لاسترداد حاتمة BrdU بواسطة حامض إما قاسية (حمض الهيدروكلوريك) أو أنزيم هضم ، والتي ليس من الضروري بالنسبة EDU الوسم.

figure-protocol-1
الشكل 1. ممثل المقابل تدخل الفرق (DIC) صور الجنينية (يسار) والكبار (يمين) الظهرية العقدة الجذر (DRG) الخلايا العصبية التي تستخدم عادة لالبارات. تحليل = 10 ميكرومتر.

figure-protocol-2
الشكل 2. الرسم التخطيطي يمثل الإجراء لوصفها في ايدو و mtDNA مع الإشارات الفلورية الخضراء. التخطيطي يمثل بروتوكول ثلاث خطوات لوصفها في ايدو و mtDNA مع الإشارات الفلورية الخضراء. Mitotically نشط خلايا العصبية F11 بمثابة السيطرة الإيجابية وتوضيح نمط توسيم ايدو التي تأسست في الحمض النووي والميتوكوندريا. الخطوة الأولى (P1) إلى إدماج التناظرية ثيميدين في تصنيعه حديثا و mtDNA التي تفرخ الخلايا في وجود ايدو. ويستند الخطوة الثانية (P2) في الكيمياء فوق لتسمية ايدو تدمج مع ولاية أوريغون الأخضر أزيد. إشارة خضراء مرئيا في نوى الخلايا التي نسخ الحمض النووي النووية. أما الخطوة النهائية (P3) هو تضخيم غرام أوريغونثم التابعين ، التي يحتضنها آزيد إشارة الضد مع الأرنب HRP - مترافق ضد الخضراء التي حضانة ولاية أوريغون مع فلور اليكسا 488 tyramide المسمى في حضور بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) لتصور في إشارة خضراء و mtDNA.

figure-protocol-3
الشكل 3. يتم تحضين ايدو توسيم و mtDNA في عقدة الجذر الظهري (DRG) الخلايا العصبية. العصبونات مع ايدو ويتم تضخيمه في وقت لاحق الإشارة إلى أن تكشف و mtDNA أدرجت ايدو. مضان ممثل الصور المنقولة مضافين على ضوء أخضر منقط إشارات من ايدو تضخيم (EDU - OG - TSA ، أخضر) و mtDNA توليفها دمجها حديثا من كلا الجنينية (A) والكبار (دينار بحريني) DRG الخلايا العصبية. الإجراء العلامات ايدو يسمح لتلطيخ المناعي لاحقة من علامات العصبية مثل neurofilament (D ، αNF ، باللون الأحمر). أشرطة النطاق = 10 ميكرومتر.

figure-protocol-4
الشكل 4. الرسم التخطيطي يمثل الإجراء لوصفها في ايدو و mtDNA مع الإشارات الحمراء الفلورسنت. التخطيطي يمثل بروتوكول ثلاث خطوات لوصفها في ايدو و mtDNA مع الإشارات الحمراء الفلورسنت. Mitotically نشط خلايا العصبية F11 بمثابة السيطرة الإيجابية وتوضيح نمط توسيم ايدو التي تأسست في الحمض النووي والميتوكوندريا. الخطوة الأولى (P1) إلى إدماج التناظرية ثيميدين في تصنيعه حديثا و mtDNA التي تفرخ الخلايا في وجود ايدو. ويستند الخطوة الثانية (P2) في الكيمياء فوق لتسمية ايدو تدمج مع ولاية أوريغون الأخضر أزيد. إشارة خضراء مرئيا في نوى الخلايا التي نسخ الحمض النووي النووية. أما الخطوة النهائية (P3) هو تضخيم الأخضر آزيد أوريغون إشارة من يحتضنها مع الضد الأرنب HRP - مترافق ضد الخضراء ولاية أوريغون تليها الحضانة مع فلور اليكسا 594 tyramide المسمى في حضور بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) لتصور في إشارة حمراء و mtDNA.

figure-protocol-5
الشكل 5. BrdU وضع العلامات والإشارات مع tyramide تضخيم الإشارات الفلورية الخضراء أو الحمراء في و mtDNA. الرسم التخطيطي يمثل الإجراء لوصفها في BrdU و mtDNA توليفها حديثا مع إشارة إما أخضر أو أحمر فلوري. مطلوب خطوة أولية لاستعادة حاتمة BrdU بواسطة الأحماض إما (حمض الهيدروكلوريك) أو أنزيم هضم ، والتي ليس من الضروري لوصفها ايدو. والخطوة التالية هي احتضان مع الأضداد المضادة للBrdU الماوس الأساسي. ويعقب ذلك من خلال احتضان البيروكسيداز مع الفجل (HRP) ، مترافق الماعز المضادة للماوس الأضداد. أخيرا ، يتم تضخيم الإشارة مع tyramide الأخضر أو الأحمر fluorescently المسمى في حضور بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) في إشارة إلى تصور و mtDNA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورنا مقايسة الحساسة لتسمية و mtDNA توليفها حديثا في خلايا فردية باستخدام التضخيم إشارة tyramide من ايدو. كانت واحدة من أكبر القضايا خلال الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول نتائج غير متناسقة بين coverslips. تم إجراء تغييرات على عدة بروتوكولات Invitrogen لتجنب الخلط أحجام صغيرة على coverslips الفردية وجعل الحلول الرئيسية لاستخدامها لكافة coverslips. وميكرولتر 75-80 المستخدمة لكل 12 مم ساترة زجاجية دائرية هو حجم مثالي لتغطية كامل مساحة السطح في الوقت الذي توفر حلا كافيا لاعطاء نتائج متسقة بين العينات. وكانت الأمثل مرات الحضانة وتركيزات كاشف لكنها قد تكون رؤية تحسينات مع تعديلات عليها.

ويهدف البروتوكول لتشغيل كل عملية واحدة. ومع ذلك ، فقد تكررت بعض الخطوات مع حلول جديدة لاستعادة العينات التي فشلت بعد المحاولة الأولى. على وجه الخصوص ، وقد تكررت ردود الفعل فوق الخطوات ايدو (3،4-3،6) من دون زيادة كبيرة في مضان الخلفية. المناهضة للحضانة ولاية أوريغون الضد الأخضر HRP (4،1-4،3) والتضخيم tyramide (4،4-4،5) الخطوات التي تكررت أيضا ، ولكن في أكثر الأحيان. النتائج في إشارة إلى نسبة الضوضاء الفقراء بسبب زيادة مضان الخلفية

الكواشف الأكثر حساسية هي الاحتياطي انقر EDU - IT المضافة (G مكون) والمضادة للأرنب أوريغون الأخضر HRP الضد (العنصر الأول) من عدة انقر EDU - IT Microplate الفحص. الاحتياطي انقر ايدو - IT المضافة يتحول تدريجيا مع مرور الزمن الأصفر عند تخزينها في 4 درجات مئوية وبين 6-12 شهرا يظلم كثيرا. تخزين اضغط المضافة لتقنية المعلومات في مخزن ايدو -20 درجة مئوية وسوف تخفف من هذه المسألة. ووضع العلامات والخطوات التضخيم tyramide تعمل بشكل أفضل عندما يتم استخدام المضادة للأرنب أوريغون الأخضر HRP الأضداد في غضون 4-6 أشهر من إعادة تشكيل في 2 MilliQ O. درهم

وسم خفيف من ايدو في و mtDNA يسمح للمقارنات مباشرة مع علامات إضافية الخلوية 11/09 ويعزز من جدوى هذا الأسلوب أكثر من النظير ثيميدين أخرى ، مثل 5 برومو deoxyuridine - 2 (BrdU) ، الأمر الذي يتطلب معاملة قاسية لاسترداد حاتمة لها داخل الحمض النووي. مختبرنا 11-12 13-15 وغيرها قد استخدمت بنجاح لتسمية BrdU و mtDNA. تقنية وضع العلامات BrdU مشابهة لتلك المستخدمة في ايدو ولكن بعض الاختلافات الهامة (الشكل 5). بعد الخطوة permeabilization المذكورة أعلاه (3،1-3،2) ، يتم استرداد حاتمة BrdU مع خطوة تمسخ (2 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تليها ثلاث غسلات في برنامج تلفزيوني 1X). هو المسمى ثم BrdU مع الأجسام المضادة ضد BrdU الابتدائية (مخفف ناقل 01:50 مختبرات في محلول 1 ٪ من حجب عدة TSA وحضنت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية). وهناك حاجة إلى خطوة الضد الثانوية لتضخيم إشارة BrdU (الماعز المضادة للماوس على مترافق مفتش HRP من مجموعات TSA # # 2 و 5 و 1:100 المخفف في محلول 1 ٪ الحجب والمحتضنة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) قبل الخطوات TSA (4،3-4،5 أعلاه). بعد النظير ثيميدين اثنين ، وايدو BrdU ، لو mtDNA التسمية هو مفيد لإجراء التجارب التسمية المزدوجة حيث يمكن تسمية و mtDNA بالتسلسل في النبض وضع العلامات نماذج 11.

مختبرنا يستخدم ايدو وBrdU توسيم و mtDNA لدراسة تنظيم الميتوكوندريا نشوء حيوي في سياق الاعتلال العصبي السكري والمضاعفات الشائعة لمرض السكري. وقد استخدمنا بنجاح تضخيم إشارة إلى قياس التغيرات في نشوء حيوي و mtDNA في الخلايا العصبية الفردية 11-12. هذه التقنية سوف تكون مفيدة في تجارب أخرى تهدف إلى استكشاف آليات النسخ و mtDNA ودوران أو لتحديد الأدوية التي تمنع و mtDNA التوليف. وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق المبادئ الأساسية للإشارات وايدو BrdU تضخيم لدراسات أخرى لقياس تكرار الحمض النووي أو إصلاح.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS - 38849 - 076160 وDK ، ومؤسسة أبحاث السكري الأحداث مركز لدراسة مضاعفات في مرض السكري ، وبرنامج للبحوث الأعصاب واكتشاف وألفريد أ. توبمان معهد البحوث الطبية في جامعة ميتشيغان. استخدم هذا العمل المورفولوجيا وصورة كور تحليل ميشيغان مركز الأبحاث والتدريب للسكري ، بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح 5P60 DK - 20572 من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. المؤلفان بالشكر سكوت كلارك T. من المسابر الجزيئية / Invitrogen لنصائحه القيمة في مختلف انقر EDU - IT مجموعات التوسيم والتبرع السخي من الكواشف لدعم التطوير الأولي للتقنية تضخيم ايدو.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أغطية 12 ممفيشر ساينتفيك12-545-82
245 مم × 245 مم طبق المقايسة الحيويةCorning431111
Parafilm MFisher ScientificPM-996
paraformaldehyeSigma-AldrichP6148
Triton X-100Sigma-AldrichT-8532
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10Xفيشر ScientificBP399
نقل PipetFisher Scientific13-711-7M
بيروكسيد الهيدروجين ، 30٪ في الماءFisher ScientificBP2633
Click-iT EdU Microplate Assay KitInvitrogenC10214
TSA Kit # 12 ، مع HRP & # 8212 ؛ الماعز المضادة للأرانب IgG و Alexa Fluor 488 التيراميدInvitrogenT20922
TSA Kit # 15 ، مع HRP & # 8211 ؛ الماعز المضاد للأرانب IgG و Alexa Fluor 594 التيراميدInvitrogenT20925
ProLong Gold الكاشف المضاد للبهتان مع DAPIInvitrogenP-36931
الأرانب متعدد النسيلة الجسم المضاد للخيوط العصبيةChemicon InternationalAB1981
الفأر أحادي النسيلة المضاد للأجسام المضادة BrdUمختبرات ناقلاتVP-B209
مجموعة TSA # 2 ، مع HRP &# 8212 ؛ الماعز المضادة للفأر IgG و Alexa Fluor 488 التيراميدInvitrogenT20912
TSA Kit # 5 ، مع HRP & # 8212 ؛ الماعز المضاد للفأر IgG و Alexa Fluor 594 التيراميدInvitrogenT20915

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).
  2. Dimmer, K. S., Scorrano, L. (De)constructing mitochondria: what for. Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).
  3. Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
  4. Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).
  5. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  6. Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  7. Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).
  8. Heusden, J. V. an, Jong, P. de, Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).
  9. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).
  10. Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).
  11. Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  12. Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  13. Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).
  14. Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).
  15. Amiri, M., Hollenbeck, P. J. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial DNA ReplicationEdU LabelingTyramide Signal AmplificationMitochondrial BiogenesisNeuronal Subcellular CompartmentsClick ChemistryFluorescent ImagingMitochondrial DNA Copy NumberNeuronal Marker StainingMitochondrial DNA Visualization

Related Articles