مقالة منهجية

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

DOI:

10.3791/2150

⸱

ديسمبر 11, 2010

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY-University at Buffalo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف الإجراء الذي قام بإعداد ذبابة الفاكهة أجنة لتصور للنظام العصبي الجنيني خلال مرحلة التطور الجنيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجنين هو نظام ذبابة الفاكهة نموذجا جذابا للتحقيق في الأساس الخلوية والجزيئية للتنمية الخلايا العصبية. نحن هنا وصف التصور الداخلي للنظام العصبي الجنيني ذبابة الفاكهة باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات الخلايا العصبية. منذ تتميز جيدا الجنينية محيطي بأكمله العصبي المركزي والجهاز العصبي على مستوى الخلايا الفردية (Dambly - Chaudière وآخرون ، 1986 ؛. بودمر وآخرون ، 1987 ؛. بودمر وآخرون ، 1989) ، أي انحرافات يمكن لهذه النظم يمكن التعرف عليها بسهولة باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات الخلايا العصبية المختلفة. يتم جمع الأجنة النامية في أوقات معينة لضمان أن الأجنة في المراحل التنموية المناسبة لالتصور. بعد جمعها ، وإزالة الطبقات الخارجية من الجنين ، والغشاء المغلف المشيماء المحي الذي يحيط الجنين ، قبل التثبيت. ثم يتم تحضين الأجنة مع الأجسام المضادة الخلايا العصبية وتصور باستخدام الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى. أجنة في مراحل 12-17 هي تصور للوصول إلى النظام العصبي الجنيني. في المرحلة ال 12 فرقة الجرثومية يبدأ الجهاز العصبي المركزي وتقصير مرحلة 15 أحرز نمط محدد للصوار. قبل 17 مرحلة يتم تطويره بالكامل العقود في الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي (كامبوس اورتيغا وآخرون 1985). بالتالي يمكن تغيير في نمط الجهاز العصبي المحيطي والجهاز العصبي المركزي يلاحظ بسهولة خلال هذه المراحل التنموية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الكواشف

  1. يعد استخدام أنابيب عازلة PEMFA 100mM ، EGTA 2mm و، و 1 ملي MgSO 4. ضبط الرقم الهيدروجيني للعازلة ل7.0. غير معقمة تصفية العازلة PEMFA وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. إعداد PBT بإضافة 1ml من تريتون X - 100 ل100ML 1X PBS (الفوسفات التخزين المؤقت مالحة) (الرقم الهيدروجيني 7.0). المحل في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد جيش صرب البوسنة 5 ٪ (الأبقار مصل الزلال) مع 0.01 ٪ في NaAcide PBS 1X (الرقم الهيدروجيني 7.0).
  4. تحضير المحلول الملحي باستخدام كلوريد الصوديوم 0.7 ٪ و 0.03 ٪ تريتون X - 100 في الماء منزوع الأيونات.
  5. إعداد مثبت من خلال الجمع بين 4 أجزاء PEMFA العازلة مع فورمالديهايد جزء 1 37 ٪.

2. جمع الأجنة

  1. تحضير قفص لسلالة ذبابة الفاكهة ذات الاهتمام بوضع> 100 ذبابة في زجاجة بلاستيكية تحتوي على محول مع لوحة التغذية آغار.
  2. مغادرة قفص من الذباب في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة ، وتغيير لوحات كل 8-12 ساعة ، بحيث تحصل على تأقلم الذباب على القفص ولا تحمل بيضها.
  3. للتجربة جمع الأجنة لمدة 12 ساعة. إزالة طبق بيتري من الحاويات واستبدالها. تأخذ طبق بيتري إزالتها وغسل الأجنة خارج الطبق باستخدام محلول ملحي ، وفرشاة الدهان النظيفة.
  4. جمع الأجنة في منخل الغرامة. التشطيف مع المياه المالحة لإزالة أي الخميرة الزائدة.
  5. باستخدام ملعقة اختيار برفق حتى الأجنة ووضعها في قارورة زجاجية صغيرة مع قبعة. إضافة نحو 1ml من محلول ملحي.

3. إزالة الأغشية كوريون والمحية والتثبيت

  1. بعد جمع الأجنة ، يعد الحل الهيبتان فيكس من خلال الجمع بين 50 ٪ و تثبيتي هيبتان 50 ٪. وسيتم حل مع الطبقات هيبتان على رأس وتثبيتي في القاع.
  2. في قارورة زجاجية غسل الأجنة التي تفرخ لهم في محلول ملحي لمدة 5 دقائق. إزالة الملوحة الزائدة باستخدام ماصة باستور.
  3. شطف مع الماء منزوع الأيونات الأجنة.
  4. Dechorionate الأجنة التي تفرخ لهم في المبيض بنسبة 50 ٪ لمدة 3 دقائق.
  5. شطف جيدا بالماء الأجنة منزوع الأيونات.
  6. إصلاح الأجنة التي تفرخ لهم لمدة 30 دقيقة في حل الهيبتان فيكس مع اهتزاز لطيف.
  7. باستخدام ماصة باستور محل تثبيتي (الطبقة السفلي) مع ترك هيبتان الميثانول في الأنبوب. هزة بقوة لإزالة الغشاء المحي. والأجنة devitellinized تنزل الى قاع الأنبوب.
  8. جمع الأجنة في قارورة زجاجية جديدة باستخدام ماصة باستور. شطف الأجنة خمس مرات مع الميثانول ، واحتضان كل مرة الأجنة لمدة 5 دقائق.

4. يلطخ الأضداد ، تركيب ، والتخيل

  1. ترطيب الأجنة في خليط من حل PBT 50 ٪ والميثانول بنسبة 50 ٪ لمدة 5 دقائق. ثم في محلول ترطيب PBT 100 ٪ لمدة 5 دقائق.
  2. كتلة الأجنة التي يحتضنها منهم في جيش صرب البوسنة 5 ٪ مع الحل NaAcide 0.01 ٪ لمدة 1 ساعة بمعدل 4 درجات مئوية.
  3. الأجنة هي الآن جاهزة للتلوين الأجسام المضادة. إعداد الأجسام المضادة الأولية عن طريق تمييع لتركيز المناسبة باستخدام BSA 5 ٪ مع الحل NaAcide 0.01 ٪. نستخدم جسم ضد بروتين السيستين سلسلة (CSP) ، وهو بروتين الحويصلي متشابك والبيروكسيداز الفجل المضادة للحصان أو HRP الأضداد ، والذي يعترف العصبية محددة شاردة الكربوهيدرات الموجودة في المياه السطحية والتسميات جليكوبروتينات جميع الخلايا العصبية.
  4. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في حل الأجسام المضادة الأولية.
  5. في اليوم التالي ، وغسل الأجنة 10 مرات مع PBT على مدى ساعة.
  6. إعداد الحل الضد الثانوي بحلول تمييع تركيز مناسبة. نستخدم الأضداد اليكسا الثانوية في تركيز 1:200.
  7. احتضان الأجنة لمدة ساعتين في 4 درجات مئوية في حل الضد الثانوية.
  8. غسل الأجنة 10 مرات مع PBT على مدى ساعة.
  9. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في متوسطة Vectashield التركيب.
  10. جبل الأجنة على شريحة زجاجية وختم زلة تغطية بطلاء الأظافر. تصور أجنة باستخدام مجهر مضان.

5. ممثل النتائج

figure-protocol-1
CSP
figure-protocol-2
HRP - FITC
figure-protocol-3
اندمج
الشكل 1 : صور الممثل تبين CNS الجنينية في مرحلة 16-17 ، باستخدام أجسام مضادة ضد CSP (الحمراء) ، وHRP (الخضراء). لاحظ تلوين المتميزة للصوار.

figure-protocol-4
CSP
figure-protocol-5
HRP - FITC
"/>
اندمج
الشكل 2 : صور تبين ممثل PNS الجنينية في مرحلة 16-17 باستخدام أجسام مضادة ضد CSP (الحمراء) ، وHRP (الخضراء). لاحظ تكرار أنماط من الخلايا العصبية الطرفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجنين ذبابة الفاكهة هو نظام قوي للتحقيق التغييرات الخلوية والجزيئية أثناء تطوير الخلايا العصبية. في هذا البروتوكول قد أثبتنا كيفية تحضير الأجنة جبل كامل لالمناعية. وقد تكيفت نحن من هذا البروتوكول وصفها في بروتوكول كارول وسكوت ، 1985. ويمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاختبار الأجسام المضادة الخلايا العصبية الأخرى ، ولكن ينبغي أن يتم الاستفادة المثلى من الأجسام المضادة. كذلك ، يمكن للعيوب التنموية للPNS الجنينية والجهاز العصبي المركزي يمكن تصور بسهولة عن طريق مقارنة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويؤيد الأمين العام بأموال من جامعة ولاية نيويورك في بوفالو من مؤسسة جون وOishei ر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فورمالدهيد بتركيز 37%Fisher ScientificBP531-25
بروتين الصدمة الباردة (CSP)بنك الهجين للدراسات النمائية
HRP-FITCJackson ImmunoResearch323-095-021
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgGInvitrogenA-11004
وسط تثبيت VectashieldVector LaboratoriesH-1000

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
  2. Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
  3. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
  4. Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
  5. Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة