مقالة منهجية

في التصور المجراة من الحويصلات متشابك ضمن محاور عصبية ذبابة الفاكهة القطاعي اليرقات

DOI:

10.3791/2151

⸱

أكتوبر 15, 2010

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY-University at Buffalo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يناقش هذا البروتوكول تشريح حية ذبابة الفاكهة اليرقات لغرض التصوير حركة الحويصلات GFP محواري الموسومة على المسارات أنيبيب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضيح آليات النقل محواري أثبتت أنها مهمة جدا في تحديد كيفية العيوب في وسائل النقل لمسافات طويلة تؤثر أمراض عصبية مختلفة. يمكن عيوب أساسية في هذه العملية لها آثار ضارة على أداء الخلايا العصبية والتنمية. قمنا بتطوير بروتوكول التشريح الذي تم تصميمه لفضح

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد إعداد العازلة تشريح بإضافة مركبات التالية : 128 مم كلوريد الصوديوم ، 1MM EGTA ، 4 مم MgCl 2 ، 2mm وبوكل ، HEPES 5mm ، و السكروز و 36 ملم في 1000 PH ، إلى 7.2 مل وتصفية تعقيم.

2. التحضير للتشريح

  1. Siligard المكعب : هو قطع الجل إلى حوالي بوصة واحدة واسعة ، 1 بوصة طويلة وحوالي 1cm عالية. يتم وضع المكعب الجل على شريحة زجاجية أثناء تشريح. ويمكن استخدام مكعبات أكثر من مرة.
  2. دبابيس : دبابيس تستخدم لتشريح يلزم اضافية قصيرة. في الجزء السفلي من المسامير الحادة minutien يعمل بشكل أفضل في تشريح.
  3. حاجة واحدة في الربيع microdissection حادة المقص.
  4. تحتاج اثنين ملقط يميل بشكل جيد.

3. جمع اليرقات

  1. 3 تجول اليرقات طور مرحلي الثالثة التي تعبر عن البروتين GFP حويصلة الموسومة يتم جمعها على طبق بتري.
  2. تغسل في ماء منزوع الأيونات اليرقات للتخلص من جميع المواد الغذائية.

4. تعيش تشريح اليرقات

  1. يتم نقل يرقة إلى تشريح مكعب الجل على شريحة زجاجية. غير منغمسين في اليرقة العازلة تشريح.
  2. وموهون يرقة في الأمامي والخلفي باستخدام اثنين من الدبابيس بشكل جيد مع الجانب الظهري تصل.
  3. باستخدام مقص microdissection ، يتم إجراء قطع صغير في المنتصف قرب نهاية الخلفي. من هذا يتم إجراء شق طريق إلى قطع الأمامية. باستخدام اثنين من دبابيس ، دبوس إهاب قطع على الحواف الجانبية.
  4. إضافة قطرة من تشريح العازلة. إزالة بعناية القناة الهضمية والأمعاء والهيئات الدهون بالملقط. معظم هذه الأنسجة طين عادة من خلال القطع الظهرية.
  5. استبدال العازلة مع الطازجة العازلة تشريح. يجب أن تكون جافة اليرقة أبدا ، وينبغي أن يكون دائما في تشريح العازلة.
  6. تتم حضانات تستخدم في الجسم الحي أو علامات MitoTracker LysoTracker في هذا الوقت ، من خلال تمييع في علامة حية في تشريح العازلة. بعد حضانة في علامة فيفو غسل اليرقة تشريح عدة مرات (5 يغسل سريع) باستخدام الطازجة العازلة تشريح.
  7. بعد استبدال غسل الماضي دفع المسامير في syligard ساترة وعلى الفور. اليرقات جاهز الآن للمراقبة.

5. تعيش اليرقات التصوير تشريح

  1. ضع ساترة والجل على خشبة المسرح والصورة باستخدام مجهر مجهر مقلوب.
  2. نستخدم عدسة 100X إلى الحويصلات صورة الموسومة الأعصاب داخل القطعة اليرقات. هو أولا تقييم GFP التعبير في الهيئات خلية من خلايا العقدة البطنية قبل أن يتم تصوير الأعصاب قطعي. إذا لوحظ قوية تلطيخ GFP في الهيئات خلية في بطني العقدة ، ثم يتم تصوير الأعصاب واستخدامها في التقييم.
  3. باستخدام نظام عرض ثنائي مع المرشحات لCFP / YFP أو YFP RFP / وتقسيم البرنامج عرض في وقت واحد يمكننا صورة اثنين من البروتين المفتاحية في الجسم الحي.

6. ممثل النتائج

figure-protocol-1
الشكل 1 : صورة تظهر حويصلات ممثل محواري محواري كثيرة على مسارات عديدة في عصب قطعي اليرقات لاحظ النقط GFP ، تمثل تراكمات محواري.

figure-protocol-2
الشكل 2 : صورة ممثل يظهر مسار واحد مع محواري محواري حويصلات عديدة داخل عصب قطعي اليرقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في مجال التصوير فيفو النقل حويصلة متشابك داخل الأعصاب يرقات ذبابة الفاكهة قطعي هو أداة قوية لدراسة آليات النقل في محواري. لقد اعتدنا في السابق على هذا البروتوكول لتقييم ديناميات النقل داخل الأعصاب اليرقات يكرر الإعراب عن توسيع polyQ لتوضيح كيفية توسيع يكرر تؤثر على ديناميات النقل حويصلة 3. ويمكن استخدام هذا البروتوكول يتم تحديد سرعة حركة الحويصلة عن طريق تحويل الفيديو إلى تيارات kymograph. استخدام علم الوراثة ، ويمكن نقل GFP الحويصلة يمكن تصور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويؤيد الأمين العام بأموال من جامعة ولاية نيويورك في بوفالو من مؤسسة جون وOishei ر.

وأيد عضو الكنيست من قبل الطلاب جائزة البحوث التي CURCA في UB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زوج واحد من مقصات التشريح الدقيقFine Science Toolsمقصات زنبركية – شفرة 6mm. قطر الطرف 0.125 mm
زوجان من الملاقطFisher Scientificملاقط تشريح Fisherbrand Micro-Adson ذات طرف مسنن
علبة دبابيس تشريحFine Science Toolsدبابيس Minutien بقطر 0.1mm

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
  3. Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة